1、家蠶（Bombyx mori）作為鱗翅目昆蟲的模式生物在中國的飼養(yǎng)歷史悠久，在絲綢產(chǎn)業(yè)以及生物學研究中具有重要的地位。家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, BmNPV)是世界上最早發(fā)現(xiàn)的昆蟲病毒，屬于α桿狀病毒屬的?型桿狀病毒。由該病毒引起的疾病具有傳播快、感染力強、致死率高、難防治等特征，是養(yǎng)蠶業(yè)中三大病毒病中危害最為嚴重的一種，嚴重影響并阻礙蠶絲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。BmNPV侵染

2、家蠶及家蠶抗病毒感染的分子機制的探究一直以來是本領域的重點和熱點，而BmNPV入侵家蠶的分子機制至今尚不完全明確。BmNPV主要通過經(jīng)口途徑感染家蠶，而在家蠶體內(nèi)中腸（Midgut）與圍食膜（Peritrophic Membrane）一起組成抵御外源微生物入侵的第一道屏障，因此從中腸與圍食膜出發(fā)研究病毒與宿主的互作對了解病毒感染與家蠶免疫防御具有重要意義。
　　本實驗室前期使用一維、二維電泳技術分離家蠶中腸蛋白，并通過病毒孵育法結

3、合MALDI-TOF-MS質(zhì)譜技術篩選并鑒定得到了12個與BmNPV互作的中腸蛋白，這些蛋白分別為：60kDa heat shock protein（HSP60），Vacuolar ATP synthase catalytic subunit B（ATP-B），Enolase（En），Actin（Actin），Arginine Kinase（AK），Ribosomal P0 protein（RP0），Mitochondrial proh

4、ibitin complex protein2（PHB2），Phosphpglycerate kinase(PGK)，Ganglioside-induced differentiation-associate–protein（GDAP）， Regucalcin-like isoform X1(RCX1)，Calreticulin（CRT）以及Vacuolar ATP synthase catalytic subunit A（ATP-A）

5、。
　　本研究為進一步驗證這12個蛋白與BmNPV的體外互作關系，以設計的特異性引物擴增這些蛋白的基因，并將這些基因分別連接到表達載體pET-28a或pGEX-4T-1上構建重組質(zhì)粒，轉化至E.coli BL21（DE3）中使用IPTG進行誘導表達，使用親和層析法純化表達的融合蛋白，Western Blot檢測純化的蛋白。分別使用正向與反向的Far Western Blot技術驗證這些蛋白與病毒的相互作用。
　　為探究圍食膜

6、在BmNPV入侵時的作用，我們選取感性品系P50與抗性品系A35家蠶分別進行添食與不添食BmNPV處理，選取不同時間段圍食膜進行掃描電子顯微鏡觀察圍食膜形態(tài)學變化。提取圍食膜總蛋白，結合Far Western Blot與LC-MS/MS質(zhì)譜篩選并鑒定與病毒具有互作關系的圍食膜蛋白，使用 RT-qPCR對對應基因在不同抗性品系P50、A35、BC9以及添食BmNPV后進行轉錄水平驗證。研究結果如下：
　　1、成功提取了家蠶中腸總RN

7、A并反轉錄獲得cDNA，獲得了12個目的基因且測序結果與NCBI上公布的序列一致。重組質(zhì)粒構建成功并誘導表達出目的蛋白，并對表達的融合蛋白進行了純化。
　　2、純化的目的蛋白與BmNPV的雙向互作結果表明除AK、RCX1外其他目的蛋白均得到了明顯的雜交信號條帶，進一步明確了BmNPV與這些蛋白的互作關系。
　　3、掃描電子顯微鏡結果顯示添食BmNPV后，P50圍食膜在4h就出現(xiàn)破損，而A35在6h后才開始破損，P50圍食膜在

8、12h出現(xiàn)大量穿孔而同時間點的A35只有少量穿孔，表明圍食膜在抵御BmNPV入侵中具有重要作用。
　　4、獲得了3個能與BmNPV結合的圍食膜蛋白，質(zhì)譜鑒定顯示這3種蛋白均為蛋白酶類，分別為Triacylglycerol lipase（TGL）、Serine protease precursor（SPP）和Trypsin-like protease（TLP）。RT-qPCR分析顯示其對應基因在不同抗性品系家蠶以及添食BmNPV后的