1、本研究的目的是探討源于胎兒生殖嵴三黃雞胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem cell，ES細(xì)胞)的分離培養(yǎng)及甜菜堿對(duì)其增殖和分化的影響。通過(guò)研究甜菜堿對(duì)三黃雞ES細(xì)胞物質(zhì)合成、抗氧化的作用，以及對(duì)三黃雞ES細(xì)胞體外分化、定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響，揭示甜菜堿調(diào)節(jié)三黃雞ES細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用機(jī)理，闡明甜菜堿在雞ES細(xì)胞分化中的作用。 1、采用酶消化法從5.5天三黃雞胎兒生殖嵴分離獲得雞原始生殖細(xì)胞，體外抑制分化培養(yǎng)，來(lái)源于原

2、始生殖細(xì)胞的ES細(xì)胞克隆形成典型的“鳥(niǎo)巢”狀集落。AKP和PAS染色，ES細(xì)胞呈陽(yáng)性。ES細(xì)胞具有多分化潛能，能分化形成類(lèi)胚體，也能分化為上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞。這表明分離培養(yǎng)的雞ES細(xì)胞具有典型的胚胎干細(xì)胞特性。 2、采用不同濃度的消化液和不同消化時(shí)間，從5.5天的三黃雞胎兒生殖嵴分離獲得原始生殖細(xì)胞，用含不同濃度犢牛血清的抑制分化培養(yǎng)液培養(yǎng)來(lái)源于雞原始生殖細(xì)胞的ES細(xì)胞，測(cè)定ES集落數(shù)，探討消化液濃度、消化時(shí)間、犢牛血

3、清對(duì)雞ES細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，采用0.1％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化液從雞生殖嵴分離原始生殖細(xì)胞的效果最好，消化時(shí)間是4 min。在抑制分化培養(yǎng)液中添加20％NBS培養(yǎng)雞ES細(xì)胞的效果最好，繼代消化時(shí)間是40 s。 3、在抑制分化培養(yǎng)液中分別添加5、10、15、20 mmol/L甜菜堿，培養(yǎng)雞ES細(xì)胞，對(duì)照組雞ES細(xì)胞僅用抑制分化培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察雞ES細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)行為，測(cè)定雞ES細(xì)胞集落數(shù)、傳代數(shù)，以及蛋白質(zhì)

4、、DNA和RNA含量，并對(duì)添加不同濃度甜菜堿對(duì)雞ES細(xì)胞是否存在毒性作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，①添加5、10、15 mmol/L甜菜堿可提高雞ES細(xì)胞克隆數(shù)和傳代數(shù)，以添加15 mmol/L甜菜堿效果最好，傳代數(shù)可達(dá)10代。添加20 mmol/L甜菜堿組的雞ES細(xì)胞從1代和2代開(kāi)始克隆的集落數(shù)急劇下降，僅傳至第五代。②與對(duì)照組相比，各添加甜菜堿組均可極顯著(P<0.01)提高雞ES細(xì)胞蛋白質(zhì)含量，以添加15 mmol/L甜菜堿效果最好。添

5、加10、15 mmol/L甜菜堿組可極顯著(P<0.01)提高雞ES細(xì)胞DNA含量，添加20 mmol/L甜菜堿則降低雞ES細(xì)胞DNA含量，但差異不顯著(P>0.05)。③與對(duì)照組相比，添加5、10、15mmol/L甜菜堿能提高雞ES細(xì)胞增殖率，對(duì)雞ES細(xì)胞無(wú)毒害作用。而添加20mmol/L甜菜堿雞ES細(xì)胞增殖率降低，對(duì)雞ES細(xì)胞有毒害作用。 4、外源性氧化劑H2O2制備雞ES細(xì)胞氧化損傷模型，探討甜菜堿對(duì)雞ES細(xì)胞抗氧化作用的

6、影響。結(jié)果表明，添加10、15 mmol/L，甜菜堿極顯著(P<0.01)提高氧化狀態(tài)下雞ES細(xì)胞SOD和GSH-Px酶活性，15 mmol/L甜菜堿還顯著減少M(fèi)DA的產(chǎn)生(P<0.05)。添加20 mmol/L甜菜堿極顯著(P<0.01)提高氧化狀態(tài)下雞ES細(xì)胞SOD和GSH-Px酶活性，但比添加15 mmol/L甜菜堿的抗氧化作用弱。 5、在培養(yǎng)液中添加不同含量甜菜堿，探討甜菜堿對(duì)雞ES細(xì)胞體外分化的影響。結(jié)果表明，甜菜堿對(duì)

7、雞ES細(xì)胞無(wú)定向誘導(dǎo)分化作用，且抑制雞ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。 6、維甲酸(retinoic acid，RA)聯(lián)合甜菜堿體外定向誘導(dǎo)雞ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，對(duì)照組僅添加RA，測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞分化率，探討甜菜堿對(duì)由RA定向誘導(dǎo)雞ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，聯(lián)合添加RA和甜菜堿或僅添加RA均誘導(dǎo)74％～85％雞ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，分化形成的神經(jīng)細(xì)胞呈網(wǎng)狀連接，大部分為雙極細(xì)胞，有小部分分化細(xì)胞胞體成多邊形，有多個(gè)短突起

8、，類(lèi)似多級(jí)神經(jīng)元。添加10、15 mmol/L甜菜堿能顯著(P<0.05)提高神經(jīng)細(xì)胞分化率，促進(jìn)RA定向誘導(dǎo)雞ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，且以添加10 mmol/L甜菜堿效果最好。 綜上，從雞胚胎生殖嵴分離培養(yǎng)的雞ES細(xì)胞具有典型的胚胎干細(xì)胞特性。甜菜堿可以促進(jìn)雞ES細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，同時(shí)發(fā)揮著抗氧化作用，但高劑量(20mmol/L甜菜堿)對(duì)雞ES細(xì)胞有毒害作用，抑制三黃雞ES細(xì)胞增殖。雞ES細(xì)胞分化研究表明，甜菜堿對(duì)雞ES細(xì)胞無(wú)定