1、合浦珠母貝(Pinctada fucata)是重要的海水養(yǎng)殖貝類和生產(chǎn)珍珠的主要母貝。然而與脊椎動物不同的是,貝類等無脊椎動物的生長機制仍不清楚,至今仍未克隆到與脊椎動物生長激素類似的基因。消化酶是重要的代謝酶類,而淀粉酶(amylase)是植食性動物的重要消化酶,在以藻類為餌料的貝類碳水化合物代謝中起重要作用,對貝類生長具有重要影響。本研究克隆了合浦珠母貝α-淀粉酶基因全長,分析了其基因結(jié)構(gòu)及組織表達模式;采用直接測序法篩選了基因SN

2、P多態(tài)位點并將其與生長性狀進行了關(guān)聯(lián)分析;運用熒光定量方法檢測了基因表達水平對不同養(yǎng)殖生態(tài)因子及貝齡的應(yīng)答,以期為探討貝類生長的分子機制奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
　　1、獲得α-淀粉酶基因的cDNA全長、基因組結(jié)構(gòu)及其組織表達特征。采用RT-PCR和cDNA末端快速擴增技術(shù)克隆獲得了1704 bp的α-淀粉酶cDNA全長(GenBank登錄號:JX683681),其中5’UTR長17 bp,3’UTR長118 bp,開放閱讀框長1

3、569 bp,編碼由522個氨基酸組成的多肽。SignalP4.0軟件分析表明,該多肽具有20個氨基酸組成的信號肽。多重序列比對顯示,合浦珠母貝α-淀粉酶與大珠母貝α-淀粉酶的序列一致性最高(91.6％);系統(tǒng)發(fā)育樹顯示其與大珠母貝親緣關(guān)系最近。在cDNA序列基礎(chǔ)上,利用常規(guī)PCR方法及染色體步移技術(shù)克隆獲得了10850 bp的基因組 DNA序列(GenBank登錄號:JX683680),其中包括9個外顯子,8個內(nèi)含子和3932 bp的

4、啟動子,啟動子區(qū)域存在典型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列 GATA-1,AP-1和 SP1等。采用熒光定量RT-P C R技術(shù)分析α-淀粉酶的組織表達特征,發(fā)現(xiàn)其在消化腺、腸、性腺、腮、肌肉、外套膜均有表達,其中消化腺當(dāng)中表達量最高,并與其它組織差異極顯著(P<0.001)。
　　2、SNP篩選及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析。對α-淀粉酶基因進行分段擴增,采用直接測序法,共獲得候選SNP(single nucleotide polymorphisms,

5、單核苷酸多態(tài)性)位點207個。SNP密度為平均每43bp發(fā)現(xiàn)一個SNP,其中啟動子區(qū)域密度為1 SNP/209 bp,外顯子區(qū)域密度為1 SNP/98 bp,內(nèi)含子區(qū)域密度為1 SNP/25 bp。位點突變類型包括轉(zhuǎn)換、顛換和插入/缺失突變,三者所占比例分別為47.82%、44.93%、7.25%。編碼區(qū)的15個 SNP包括2個非同義突變及13個同義突變。兩個全同胞家系(編號1＃,2＃)的分型結(jié)果顯示23個位點中有7個位點呈現(xiàn)單態(tài),位點

6、+4986(T/G)和+4989(C/T)呈現(xiàn)三態(tài),其余的14個位點均呈現(xiàn)二態(tài)。分析所有14個二態(tài)位點的基因型及等位基因頻率發(fā)現(xiàn)除+4453(A/C)位點外,所有位點的等位基因頻率在兩個家系中均差異極顯著(P<0.01)。兩個家系的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示二者平均多態(tài)信息含量(PIC)值分別為0.2837、0.1587,Shannon指數(shù)分別為0.5245、0.2947,表明1＃家系遺傳多樣性更豐富?；蛐团c性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示-201(

7、G/T)、+3523(G/A)、+4402(A/G)、+5025(T/A)、+6379(T/A)、+6481(T/C)、+6523(T/A)7個位點各基因型個體之間部分生長性狀存在顯著差異(P<0.05)。11個 SNP位點組成的雙體型與性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),雙體型 S1、S3、S4、S9個體所有生長性狀(殼長、殼高、殼寬、總重、軟體重)均高于S2、S5、S6、S7、S8、S10,且差異顯著(P<0.05)。另外S1各性狀值在所有雙體型中

8、最高。可見總體來看S1、S3、S4、S9屬于優(yōu)勢類型,而S1又優(yōu)于其它3類,因而可以進一步開展重復(fù)驗證工作以期將其運用于育種實踐。
　　3、開展了對生態(tài)因子的表達響應(yīng)研究。運用實時熒光定量 PCR技術(shù)對不同溫度、鹽度、餌料濃度、吊養(yǎng)水層及貝齡條件下合浦珠母貝α-淀粉酶基因表達量進行了測定。結(jié)果表明,21℃時α-淀粉酶 mRNA表達量最高,低于或高于此溫度(17℃、25℃、29℃、33℃)時,表達量均呈現(xiàn)下降趨勢,且差異顯著(P<0

9、.05)。α-淀粉酶 mRNA相對表達量隨鹽度升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,表達量最高值出現(xiàn)在鹽度27時,并與其它各鹽度(15、21、33、39)間差異顯著(P<0.05)。餌料濃度從8×104 cell·ml-1升高至20×104 cell·ml-1的過程中,表達量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,濃度為16×104 cell·ml-1時表達量最低。吊養(yǎng)深度對α-淀粉酶mRNA相對表達量影響較大:淺水層(1 m、2 m、3 m)低于深水層(4 m