1、陽春砂是一種重要的南藥之一，其藥用成分以揮發(fā)油為主，包括α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、檸檬烯、香葉烯、芳樟醇、石竹烯、乙酸龍腦酯等揮發(fā)性萜類成分。植物體內揮發(fā)性萜類的合成主要由萜類合酶完成。萜類生物合成途徑階段Ⅰ中合成萜類骨架的關鍵酶已比較清楚，但對揮發(fā)性萜類的合成起到直接環(huán)化和修飾作用的是階段Ⅱ、Ⅲ的萜類合酶（即下游萜類合酶），現在關于下游萜類合酶的研究甚少。轉錄因子是指與靶基因的啟動子或增強子結合，調控下游功能基因表達的一類結合蛋白。獲

2、得調控相關萜類合酶基因表達的關鍵轉錄因子能為有效地提高陽春砂揮發(fā)性萜類成分的含量提供研究靶點。
　　目的:
　　轉錄因子具有“多點調控”的優(yōu)勢，作為上游的調控元件，既能調控植物激素信號轉導的轉錄水平，又能調控萜類合成，應用基因工程改造轉錄因子從而定向調控次生代謝物積累具有良好的發(fā)展前景。然而，現有研究中有關轉錄因子的研究仍有諸多空白。因此，本論文擬深入分析茉莉酸甲酯(Methylj asmonate，MeJA)誘導陽春砂果實

3、中參與茉莉酸(Jasmonate，JA)信號轉導及萜類合成途徑的相關轉錄因子基因，旨在全面認識陽春砂轉錄因子在萜類生物合成途徑中的調控過程，為利用基因工程改造陽春砂，定向增加陽春砂揮發(fā)性萜類的產量奠定理論基礎，促進中藥種質生物化學的研究及基于轉錄因子的代謝工程研究。
　　方法:
　　2.1 陽春砂轉錄因子及其相關萜類合酶基因的挖掘
　　利用MeJA誘導的陽春砂轉錄組及表達譜數據，以本地blast及注釋方法篩選差異表達轉

4、錄因子基因。再上呈所篩選的轉錄因子蛋白至NCBI CDD和Plant TFcat服務器進行轉錄因子保守結構域分析。結合轉錄組數據和生物信息學方法篩選共表達的轉錄因子及萜類合酶基因(unigene)。最后，結合轉錄組數據與次生代謝產物數據構建權重網絡分析模型，挖掘出與萜類相關的轉錄因子及萜類合酶基因。
　　2.2 熒光定量PCR實驗
　　提取陽春砂果實的果皮及種子團部位的總RNA，并反轉錄成cDNA。根據候選基因(unigen

5、e)的序列設計引物并驗證引物的有效性，篩選最佳退火溫度。通過擴增效率、標準曲線相關系數和標準曲線對引物對進行評估，若有需要則重新設計引物。最后，應用實時熒光定量PCR測定候選基因的Cq值并以2-ΔΔCT計算其相對表達量。
　　2.3 高濃度茉莉酸甲酯噴施陽春砂
　　將成熟期長勢相近的果實的陽春砂植株隨機分為溶劑組、MeJA噴施果實組，分別噴施含0.0001％吐溫-80純水的溶劑、600μmol·L-1 MeJA和1000μm

6、ol·L-1MeJA于陽春砂果實中，同時設空白組（不作任何處理），噴施后24h采集。
　　2.4 MeJA誘導的陽春砂果實內源茉莉酸含量的分析
　　陽春砂樣品粉末進行高效提取，減壓濃縮后利用固相萃取進行富集，減壓濃縮后以甲醇溶解，利用LC/MS測定樣品中JA含量。
　　2.5 候選轉錄因子的生物信息分析
　　以SubLoc、PSORT、TargetP預測轉錄因子的亞細胞定位和核定位信號肽。以擬南芥基因組作參考，利

7、用planttfdb數據庫查找目標轉錄因子相似度最佳的序列并搜索其對應的相互作用蛋白。使用JASPAR2016 server預測轉錄因子與靶基因結合位點信息。最后，利用ORFfinder分析目標基因序列是否含有完整的開放閱讀框。
　　結果:
　　3.1 MeJA誘導差異表達的WRKY及相關萜類合酶基因的分析
　　本論文利用MeJA誘導的陽春砂果實RNA-Seq數據篩選出36條包含WRKY保守域的轉錄因子。通過多種生物信

8、息學分析，獲得6個差異表達的WRKY基因(AvWRKY6、AvWRKY21、AvWRKY28、AvWRKY40、AvWRKY72和AvWRKY75)，及其相關的4個萜類合酶候選基因((+)-新薄荷醇脫氫酶、S-(+)-芳樟醇合酶、(+)-大根香葉烯D合酶和月桂烯合酶基因）作為萜類合成相關的候選基因。對候選基因進行RT-qPCR驗證并預測AvWRKY40、AvWRKY28和AvWRKY72可能協(xié)同調控(+)-新薄荷醇脫氫酶基因（AvNeo

9、D）的表達，影響單萜類合成。
　　3.2 MeJA誘導差異表達的MYC及相關萜類合酶基因的分析
　　我們利用生物信息學方法篩選出5個與萜類合成相關的MYC基因（AvMYC4a、AvMYC4b、AvMYC2a、AvMYC2b和AvMYC4c）和5個萜類合酶基因（β-桉葉醇合酶、倍半萜類合酶3、倍半萜類合酶A1、大根香葉烯D合酶和芳樟醇合酶基因）。利用生物信息學方法結合轉錄組及代謝產物數據獲得與萜類合成相關的AvMYC4a、Av

10、MYC4b、AvMYC2b、β-桉葉醇合酶基因(AvEud)和大根香葉烯D合酶(AvGerD)基因。通過RT-qPCR數據構建調控模型，預測AvMYC4a、AvMYC4b可能沒有直接調控AvEud基因，但AvMYC4a可能通過激活其他萜類合酶的啟動子調控單萜類化合物合成。
　　3.3 MeJA誘導對陽春砂內源JA及其信號轉導基因的影響
　　陽春砂果皮和種子團內源JA含量變化趨于一致。JA信號轉導基因在轉錄水平存在空間差異性，

11、且不同濃度MeJA響應效率也存在差異。200μmol·L-1MeJA更能誘導JA信號轉導基因的表達。陽春砂與其他植物內JA信號轉導轉錄方式具有同一性，但植物物種間局部基因具有多樣性。根據JA信號轉導基因調控網絡推測MeJA可能誘導陽春砂果實內AvJAR1表達，募集AvJAZ1b蛋白，AvJAZ1b與AvJAZ1a相互作用后釋放出AvMYC2b，調控下游基因的表達。
　　3.4 高濃度MeJA誘導陽春砂候選基因的表達變化
　　

12、前期實驗發(fā)現MeJA處理組揮發(fā)性萜類含量比溶劑組低，這可能由于溶劑濃度過高而致。600μmol·L-1MeJA比200μmol·L-1 MeJA誘導揮發(fā)性萜類的效率更高，推測高濃度MeJA更能誘導揮發(fā)性萜類的合成。因此，以0.0001％吐溫-80作為溶劑，600μmol·L-1及1000μmol·L-1 MeJA處理陽春砂果實發(fā)現陽春砂果實內源JA均隨著MeJA濃度升高而增加。陽春砂果皮及種子團內源含量變化一致。AvMYC2b及AvNe

13、oD響應MeJA誘導，但兩者對MeJA的敏感度有所差異。AvMYC2b的表達量變化與內源JA含量變化高度一致，AvMYC2b是JA信號轉導途徑中的核心元件，由此推測果實內源JA的含量影響JA信號轉導?；蚬脖磉_網絡預測AvWRKY28與AvWRKY6協(xié)同調控AvNeoD的表達。AvMYC4a、AvMYC4b和AvWRKY72可能形成蛋白復合物進而激活AvEud的啟動子調控相應的揮發(fā)性萜類合成。
　　3.5 萜類合成基因調控網絡的初

14、步構建及關鍵基因生物信息學分析
　　脫氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，MEP)和甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑的關鍵萜類合酶基因的轉錄水平具有空間差異性，不同基因相應MeJA的濃度不一。從萜類合成關鍵基因的調控網絡模型中可推測MeJA誘導陽春砂果實內JA信號轉導，激發(fā)AvMYCs調控萜類合酶的表達，影響單萜類成分合成。AvWRKY6、AvWRKY28、AvWRKY72

15、、AvWRKY40可能主要調控單萜化合物的合成。AvWRKY75可能主要調控倍半萜類化合物的合成。AvWRKY40、AvWRKY72、AvWRKY28、Av WRK Y6、AvWRKY75和AvMYC2b可能均定位于細胞核中。除AvWRKY28和AvWRKY72外，上述候選轉錄因子均可能與其他因子互作。上述候選轉錄因子均沒有完整全長，后續(xù)可根據上述信息設計實驗進行功能驗證。
　　結論:
　　本論文以轉錄組數據結合代謝組數據獲