1、植物基因啟動(dòng)子中包含多種重要的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游相應(yīng)基因的表達(dá)，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心環(huán)節(jié)，也是研究基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理的重要內(nèi)容。通過制備啟動(dòng)子的部分序列缺失并將得到的缺失片段與報(bào)告基因構(gòu)建成融合基因，轉(zhuǎn)化后比較轉(zhuǎn)基因植株中報(bào)告基因表達(dá)狀況來研究啟動(dòng)子中一些分子元件的功能，是啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和功能研究的重要方法。
　　 Pib基因是利用圖位克隆技術(shù)從水稻中克隆出的第一個(gè)抗稻瘟病主效基因，屬于NBS-LRR抗病基因家族，前

2、人研究Pib基因供體品種植株的抗稻瘟性表達(dá)受到乙烯、茉莉酸、水楊酸，氯化鈉和黑暗等因素的誘導(dǎo)而不受病原菌接種的誘導(dǎo)。有關(guān)水楊酸、氯化鈉和黑暗等誘導(dǎo)因素與Pib啟動(dòng)子中分子元件的關(guān)系已有了轉(zhuǎn)基因分析的報(bào)道。乙烯和茉莉酸是植物防御反應(yīng)的重要信號(hào)分子，在植物對(duì)生物性和非生物性因素的抗性以及植物生長(zhǎng)和發(fā)育過程中的基因調(diào)控上發(fā)揮著重要的作用。然而，Pib基因的乙烯和茉莉酸誘導(dǎo)響應(yīng)是否是啟動(dòng)子的響應(yīng)，以及有關(guān)乙烯和茉莉酸誘導(dǎo)因素與啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)分子元件

3、的關(guān)系還需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.
　　 為了分析Pib啟動(dòng)子中應(yīng)答乙烯和茉莉酸的分子機(jī)制，確定乙烯和茉莉酸誘導(dǎo)的必需序列區(qū)域，本文采用了啟動(dòng)子缺失的方法構(gòu)建了不同長(zhǎng)度的5’端pib基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因的雙元載體,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái)和報(bào)告基因體系來研究該pib啟動(dòng)子中乙烯和茉莉酸誘導(dǎo)響應(yīng)元件的生物學(xué)功能，這將為基因表達(dá)調(diào)控的研究及抗病育種提供重要的理論依據(jù)。
　　 1.用PCR法制備了Pib全長(zhǎng)啟動(dòng)子-3572～2bp(3575

4、bp)和3個(gè)5＇端缺失片段-2692bp～2bp(2695bp)、-1335bp～2bp(1338bp)、-761bp～2bp(764bp)，得到4個(gè)不同長(zhǎng)度的Pib啟動(dòng)子分別置換掉雙元質(zhì)粒pCAMBIA1301中g(shù)us基因上游的35S構(gòu)建為重組質(zhì)粒，構(gòu)建了pNAR901、pNAR902、pNAR903和pNAR904四個(gè)植物表達(dá)載體，重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切鑒定，用農(nóng)桿菌凍融轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株EHA101中。
　　 2.利用農(nóng)桿菌

5、介導(dǎo)法，將pib全長(zhǎng)啟動(dòng)子及其5’端不同缺失體片段驅(qū)動(dòng)gus基因的四個(gè)重組雙元載體pNAR901、pNAR902、pNAR903和pNAR904和CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因的pCAMBIA1301對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化粳稻R109。經(jīng)農(nóng)桿菌侵染、潮霉素篩選、分化、壯苗，獲得pNAR901轉(zhuǎn)化植株22株、pNAR902轉(zhuǎn)化植株27株、pNAR903轉(zhuǎn)化植株20株、pNAR904轉(zhuǎn)化植株30株，pCAMBIA1301轉(zhuǎn)化植株5株，陽性率達(dá)

6、到74.8％，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR， Southern blot和潮霉素抗性鑒定，結(jié)果表明目的基因已經(jīng)整合到水稻基因組中，且外源基因大部分以單拷貝插入植物基因組。
　　 3.以Pib全長(zhǎng)啟動(dòng)子及3個(gè)5＇端不同長(zhǎng)度缺失的Pib啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)gus基因的水稻轉(zhuǎn)基因植株為材料，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中GUS活性進(jìn)行的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平的定性和定量分析結(jié)果表明，全長(zhǎng)Pib啟動(dòng)子(-3572～2bp，pNAR901)啟動(dòng)活性最強(qiáng)，茉莉酸或乙

7、烯誘導(dǎo)6h后，其驅(qū)動(dòng)下的gus基因在轉(zhuǎn)基因植株各部組織中的表達(dá)量明顯上升。而-3572～-2692bp區(qū)段序列缺失后不但Pib啟動(dòng)子啟動(dòng)活性顯著降低而且也喪失了對(duì)茉莉酸和乙烯的誘導(dǎo)活性。pNAR902(-2692～2bp)與pNAR903(-1335～2bp)和pNAR904(-761～2bp)中的Pib啟動(dòng)子序列的缺失長(zhǎng)度相差達(dá)2倍和3倍以上，但其對(duì)茉莉酸和乙烯的誘導(dǎo)響應(yīng)沒有區(qū)別。這些結(jié)果顯示這三個(gè)Pib啟動(dòng)子缺失體構(gòu)建中，其共同的缺