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簡介：本研究分為三部分第一部分大鼠TC1基因的擴增及重組慢病毒載體的構建目的構建攜帶大鼠TC1TRANSDUCEROFREGULATEDCREBACTIVITY1）目的基因的重組慢病毒，并初步檢測其體外表達目的基因的能力。方法PCR法擴增出TC1編碼區(qū)片段，定向克隆入PGCFU載體，LIPOFECTAMINE2000法轉染293T細胞包裝攜帶TC1目的基因的重組慢病毒，測序證實為TC1重組慢病毒后大量擴增，以實時定量PCR法測定病毒滴度，WESTERNBLOT法檢測TC1在293T細胞中的表達。結果成功構建了攜帶大鼠TC1目的基因的重組慢病毒，并證實其在293T細胞中可高水平表達TC1。結論大鼠TC1重組慢病毒可在體外高表達其所攜帶目的基因，為研究TC1在脊髓損傷中的作用打下基礎。第二部分TC1重組慢病毒的體外生物學效應目的研究TC1重組慢病毒載體對大鼠原代脊髓運動神經(jīng)元（SMN）的生物學效應。方法取13D新生大鼠進行原代SMN培養(yǎng)，用構建好的TC1重組慢病毒載體轉染SMN，應用RTPCR、WESTERNBLOT及細胞形態(tài)學驗證其對SMNTC1MRNA、蛋白表達的影響，以及對SMN生長情況的作用。結果成功培養(yǎng)出大鼠原代SMN，用構建的TC1重組慢病毒載體轉染原代SMN，可以明顯提高TC1MRNA和蛋白的表達水平，并改善了神經(jīng)元軸突生長情況。以正常組和空白載體組細胞作對照，實驗組TC1MRNA和蛋白表達量均有明顯提高P結論TC1重組慢病毒載體可以有效地提高SMNTC1基因表達并促進其生長，為后續(xù)動物實驗奠定了基礎。第三部分TC1重組慢病毒的體內生物學效應目的建立大鼠脊髓損傷模型，研究TC1重組慢病毒載體在脊髓損傷修復中的作用。方法取健康成年SD大鼠，切斷T10脊髓，建立脊髓損傷動物模型，術中將TC1重組慢病毒載體和PGCFU載體注入損傷區(qū)，術后2周、4周、6周進行BBB評分，并通過RTPCR、WESTERNBLOT檢測TC1MRNA及蛋白表達，同時進行免疫組化染色觀察神經(jīng)纖維再生情況。結果術后第2周，實驗組除TC1蛋白表達水平上調外組P＜005，TC1MRNA表達、BBB評分以及損傷區(qū)神經(jīng)纖維再生情況與陰性對照組沒有差異P結論TC1重組慢病毒載體可有效改善大鼠脊髓損傷，而且效果持久，具有很好的應用前景。

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簡介：目的探討大劑量甲基強的松龍與IVIG聯(lián)合治療兒童重癥病毒性腦炎的臨床療效。方法52例兒童重癥病毒性腦炎隨機分為兩組對照組20例，治療組32例。對照組給予抗病毒、降顱壓等對癥治療，治療組加用大劑量甲基強的松龍（METHYLPREDNISOLONE，MP）和IVIGINTRAVENOUSIMMUNEGLOBULIN，靜脈用人免疫球蛋白）治療。比較兩組病例熱退時間、意識好轉時間、抽搐停止時間、肢癱好轉時間及平均住院時間。結果治療組熱退時間、意識障礙好轉時間、抽搐停止時間、肢癱好轉時間及平均住院時間均與對照組比較有統(tǒng)計學差異P結論大劑量甲基強的松龍與IVIG聯(lián)合治療兒童重癥病毒性腦炎療效優(yōu)于常規(guī)治療，可較快緩解病情，減少死亡，值得推廣。

簡介：目的1體外培養(yǎng)JEGⅢ確定ADHGF感染人絨毛滋養(yǎng)層細胞JEGⅢ的最佳感染強度檢測不同時間點細胞對HGF的表達水平初步探討肝細胞生長因子HGF對JEGⅢ的調節(jié)作用為下一步實驗奠定基礎。2ADHGF以最佳感染強度轉染JEGⅢ建立乙型肝炎病毒HBV感染轉染ADHGF的JEGⅢ細胞模型從形態(tài)學及定量兩方面探討HGF對HBV感染JEGⅢ的作用為HBV宮內感染的防治提供理論依據(jù)。方法第一部分體外培養(yǎng)JEGⅢ以攜帶HGF基因的重組腺病毒ADHGF為實驗組攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒ADGFP為對照組不同感染強度MOI1025501002004008001600轉染絨毛膜癌細胞系JEGⅢ通過MTT法檢測細胞損傷程度篩選和確定最佳MOI高轉染效率且對細胞低損傷作為下一步攜帶HGF基因的重組腺病毒ADHGF轉染細胞的最優(yōu)條件。以最佳的MOI轉染JEGⅢ后0244872H后收集細胞上清用ELISA法檢測HGF蛋白的表達水平。第二部分基于前期研究于5％CO237℃的培養(yǎng)箱中用含5血清濃度的培養(yǎng)液使細胞饑餓培養(yǎng)JEGⅢ細胞至50鋪滿時ADHGF以最佳MOI200PFUCELL轉染JEGⅢ48H后再加入HBV陽性血清蘭州軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科采自乙型肝炎志愿者2108HBVDNAL使其終濃度為100DNA細胞共同孵育24H后每隔12H分別于感染HBV后2436486072H收集上清及細胞將細胞用PBS洗一遍800RMIN離心10MIN棄去上清再加入200ΜLPBS置于70℃冰箱中冷凍30分鐘再放入37℃水浴中反復凍融三次1000RMIN離心10MIN吸取上清與所收集培養(yǎng)上清混勻分別用HE、GIMSA染色及透射電鏡觀察細胞形態(tài)和結構變化熒光定量PCR檢測培養(yǎng)物中HBVDNA。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS120軟件進行統(tǒng)計分析。結果1以高轉染效率且對細胞低損傷為標準確定最佳MOI為200PFUCELL。2ADHGF轉染JEGⅢ不同時間段后ELISA法檢測HGF表達水平的結果顯示ADHGF有效的導入了細胞且HGF表達水平48H內有時間依賴性72H開始下降。3HE染色顯示Ⅱ組較Ⅰ組細胞有較明顯染色質濃縮、邊緣化核膜裂解和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。Ⅲ組較空白對照組無明顯形態(tài)學改變。GIMSA染色與HE染色結果相近。4電鏡顯示Ⅱ組較Ⅰ組細胞有較明顯細胞內線粒體嵴模糊不清或消失核周間隙增寬線粒體擴張核膜模糊等現(xiàn)象且Ⅱ組胞質內可見球形HBSAG顆粒呈圓球形Ⅳ組、空白對照組可見胞膜完整清晰核仁大而明顯細胞質內有豐富的脂滴、線粒體、高爾基器、糖原顆粒以及大量游離的核糖體兩細胞膜接近處可見明顯的細胞連接為橋粒連接。Ⅲ組較Ⅳ組無明顯變化。5分別于24H、36H、48H、60H、72H收集培養(yǎng)上清及細胞內的病毒在轉染ADHGF的情況下各時間點收集的標本中檢測到的HBVDNA量均低于未轉染ADHGF的情況有統(tǒng)計學意義P005提示HGF對HBV感染滋養(yǎng)細胞有保護作用而各時間點之間HBVDNA量差異不顯著。結論1HGF可有效導入JEGⅢ并促進細胞的增殖。2HGF可有效抑制HBV感染滋養(yǎng)層細胞。

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簡介：乙型肝炎是嚴重的肝臟感染性疾病。目前全世界慢性HBV感染者已經(jīng)超過4億，乙肝相關肝硬化和肝癌的死亡率也逐年增加，嚴重威脅著人類健康。由于目前HBV感染后慢性化的確切機制尚不清楚，所以無法制定出行之有效的治療方法和方案。HBV作為嗜肝性DNA病毒，本身對肝細胞并沒有損害，在清除病毒和造成肝細胞損傷中起關鍵作用的是CD8細胞毒性T細胞CYTOTOXICTLYMPHOCYTE，CTL。急性乙肝病毒感染可激發(fā)強烈的多表位特異性CTL應答；但慢性感染時，特異性CTL增殖、細胞因子分泌及細胞毒效應功能均發(fā)生不同程度損傷，與HBV感染持續(xù)不能清除直接相關，其原因仍待研究。T細胞的分化、活化及發(fā)揮效應功能除了需要來自TCR的第一信號，還需要來自共刺激分子的輔助調節(jié)信號。PD1是CD28家族的共刺激分子，與配體PDL結合后可阻斷TCR信號的傳遞。眾多研究表明，PD1PDL共刺激信號通路在T細胞活化、增殖和細胞因子分泌等各個過程中均發(fā)揮重要的負性調節(jié)作用。2006年，BARBER小組的研究工作發(fā)現(xiàn)，在淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒LCMV感染小鼠體內，功能衰竭的T細胞表達PD1上調，阻斷PD1與其配體之間的相互作用能使衰竭的T細胞恢復活力并顯著降低病毒載量。此后，在HIV，HCV等慢性病毒感染性中也相繼發(fā)現(xiàn)PD1PDL1通路與病毒特異性CD8T細胞功能障礙有關，該通路在慢性HBV感染中的研究也已初見報道。但是，PD1PDL通路對HBV特異性CTL分化、活化過程的影響目前仍不清楚，而特異性CTL的分化和活化是其發(fā)揮效應功能的基礎。另一方面，PD1PDL通路在HBV的感染的靶器官肝臟中的表達及其與疾病發(fā)展的關系仍未見報道。因此，為更全面地認識PD1PDL共刺激信號通路在乙型肝肝炎病毒慢性感染中對特異性CTL功能的調節(jié)作用，我們開展了以下研究首先，利用多色流式細胞儀結合PENTAMER技術檢測了PD1分子在HBV特異性CTL的表達情況。結果顯示，慢性乙肝患者HBV特異性CTL表達PD1百分率顯著增高，顯著高于作為對照的CMV特異性CTL及外周血總CD8T細胞。而分析PD1的表達水平與患者血漿病毒載量及性別、年齡和ALT水平之間關系顯示，PD1的表達水平與血漿中HBV病毒的載量正相關，與其他指標無顯著相關性。以上結果提示，可能是患者體內高載荷的HBV病毒引起了PD1表達的上調。那么PD1表達的上調對特異性CTL的分化、活化及多種抗病毒效應功能是否發(fā)生影響呢結合表面分化抗原CD27、CD45RA和趨化因子受體CCR7的表達，我們觀察了在T細胞不同分化階段PD1表達的變化，我們發(fā)現(xiàn)在CTL細胞分化的不同階段，PD1表達存在顯著差異。CCR7CD27CD45RA初始CD8T細胞PD1表達極少，在遭遇抗原后CD45RAPD1表達上調。在分化中期CCR7CD27CD45RAT細胞上PD1表達達到最高。而分化至終末階段的CCR7CD27CD45RAT細胞中，PD1表達又復下調。PD1表達與CTL分化之間存在明顯關聯(lián)。而慢性乙肝感染患者特異性CTL多集中于分化中后階段，高表達PD1分子；但作為對照的CMV特異性CTL大多高分化，PD1表達水平較低的。因此，分化與PD1表達的差異使HBV特異性CTL可能接收更強的抑制信號。通過表面活化標志檢測，我們發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者體內PD1CTL高表達活化標志CD38和HLADR。接著利用胞內因子染色法檢測抗病毒效應分子的表達，我們發(fā)現(xiàn)PD1特異性CTL胞內仍有較高的GRB的表達，但PERFMN表達低下、IFNΓ表達極低。以上表型提示慢性乙肝患者PD1特異性CTL雖然高度活化，但實際處于功能受損狀態(tài)。PD1PDL通路的抑制效應不僅取決于PD1的表達量，還取決于PD1與其配體配接的程度，因此慢性HBV感染時PDL的表達量也至關重要。于是我們檢測了外周血淋巴和單核細胞中PD1配體PDL1和PDL2的表達。結果顯示，慢性乙肝患者外周血單核細胞表面PDL1表達顯著上調，而T和B淋巴細胞群體表面PDL1的表達無顯著變化，同時PDL2在單核和淋巴細胞中的表達也沒有顯著變化。結合患者臨床信息分析發(fā)現(xiàn)，外周血單核細胞PDL1的表達量與血漿ALT水平顯著正相關。這可能提示，在肝臟炎癥增加的同時機體也開始上調免疫抑制因子以控制炎癥損傷程度。慢性乙肝感染時單核細胞上調PDL1表達是否抑制特異性T細胞的應答阻斷PD1PDL1通路又是否能夠恢復特異性T細胞的功能為回答上述問題，我們進行了PD1PDL1通路阻斷實驗分離慢性乙肝感染患者外周血PBMC進行體外培養(yǎng)，其中加入特異性表位肽刺激特異性CTL發(fā)生活化和增殖，在以上體系中利用PDL1的阻斷性抗體阻斷PD1PDL通路后觀察特異性CTL增殖和效應功能的變化。結果顯示，加入阻斷性抗體以后，特異性CTL的增殖能力顯著增強，清除病毒的重要效應因子IFNΓ的分泌能力顯著提高。上述結果提示，在慢性HBV感染患者外周血中，PD1PDL1通路參與特異性CTL的功能障礙的調節(jié)，阻斷該通路能使功能受損的特異性CTL的增殖和細胞因子分泌效應功能恢復。肝臟是HBV特異性感染的靶器官，且有研究表明PD1PDL1通路參與肝內T細胞免疫耐受的調節(jié)。因此，為闡述PD1PDL這一重要的免疫調節(jié)通路在慢性乙肝感染肝臟的表達及其在疾病進程中的可能作用，我們進行了以下研究首先，利用免疫組織化學方法檢測了PD1在慢性乙肝感染患者肝活檢組織中的表達情況。結果顯示，慢性乙肝感染肝組織中PD1陽性細胞顯著增加，且PD1分子主要表達在匯管區(qū)和肝小葉中浸潤單個核細胞上。免疫雙熒光染色實驗提示，PD1表達在CD4和CD8T淋巴細胞以及少量CD20B淋巴細胞上。這提示，在慢性乙肝感染肝臟中浸潤著大量活化的淋巴細胞，它們表達PD1分子上調。接著我們檢測了PD1的兩個配體在慢性乙肝感染肝臟中的表達。結果顯示，PDL1的表達在HBV慢性感染肝臟中顯著上調，除了浸潤炎癥細胞以外，KUPFFERS細胞、血竇內皮細胞及DC細胞等大量肝臟原位抗原遞呈細胞均上調PDL1的表達。而另一個配體PDL2的表達則沒有顯著變化。比較炎癥損傷程度不同及炎癥細胞浸潤程度不同的肝組織中原位抗原遞呈細胞上PDL1的表達，我們發(fā)現(xiàn)PDL1的表達與肝組織炎癥損傷和炎癥細胞浸潤程度均密切相關。上述結果提示，肝組織的炎癥損傷和免疫應答上調了肝臟原位抗原遞呈細胞表面PDL1的表達，這可能起到控制免疫反應強度，保護肝組織的作用。因此，PD1PDL1抑制性通路在慢性乙肝感染肝臟中上調可能起著雙重作用一方面保護肝組織免受免疫病理損傷，另一方面也導致特異性免疫應答下調、病毒持續(xù)不能清除。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝感染患者外周血及肝組織中抑制性共刺激分子PD1PDL1通路均上調，阻斷該通路能緩解特異性CTL的功能低下狀態(tài)。這對于認識HBV感染的慢性化機制有著重要意義，PD1PDL1通路的精確調控可能為慢性乙型肝炎的治療提供新的線索和思路。

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簡介：天津大學博士學位論文睡眠剝奪對大腦認知能力及腦電特征的影響研究姓名李寧申請學位級別博士專業(yè)生物醫(yī)學工程指導教師劉海嬰王明時20081201三域的特征，相位相干特征和非線性動力學特征，形成了一個相對完整的對SD影響腦認知的評價方法，為本領域已有的認知科學推斷提供了客觀支持，更深一步探索了SD的作用機制，為將來提出對SD的對抗措施提供了客觀依據(jù)。關鍵詞睡眠剝奪腦電事件相關電位時頻轉換平行因子分解相位相干性非線性分析腦信息圖

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簡介：目的研究慢性乙型肝炎CHRONICHEPATITISB，CHB患者乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV全基因組基因變異及其與干擾素INTERFERON，IFNΑ療效的關系。方法PCR擴增并克隆干擾素治療前慢性乙型肝炎患者血清中HBV全基因組DNA，測序并進行基因變異分析及其與干擾素療效的關系。結果獲得干擾素治療前慢性乙型肝炎患者來源的33株HBV全基因組DNA，它們均屬于C或B基因型。與標準株相比，HBV缺失變異在B、C基因型間的發(fā)生率分別為143％214和632％1219。其中，HBVPRES2NT19NT56缺失突變只發(fā)生在C基因型干擾素治療有效的患者中，發(fā)生率為152％533，占C基因型有效病例的50％510；TPSPACE區(qū)6株缺失變異HBV全基因組DNA中，5例干擾素治療無效，1例有效。HBV插入突變一例，3460BP，B基因型，干擾素治療無效病例。HBV點突變結果顯示4例C基因型NTG2699T變異為干擾素有效病例，占C基因型有效病例的40％，且發(fā)生在無PRES2缺失的病例中。因此，PRES2缺失變異和NTG2699T變異占C基因型有效病例的90％可作為預測干擾素應答的因素。另外，體外實驗有抗干擾素作用的T1504C、A1762T、G1764A、G1896A變異在本研究中對干擾素療效無影響。TP257研究發(fā)現(xiàn)，B基因型的H135Y和Q176H；C基因型的N89D和K142QK142E可能有抗干擾素作用。結論HBV缺失變異在B、C基因型間的發(fā)生率存在顯著性差異；HBVPRES2缺失突變和NTG2699T變異與C基因型干擾素應答相關；B基因型的H135Y和Q176H；C基因型的N89D和K142QK142E可能有抗干擾素作用。

簡介：中南大學碩士學位論文EPSTEINBARR病毒動態(tài)檢測在鼻咽癌診斷和治療中的意義姓名王巍巍申請學位級別碩士專業(yè)臨床檢驗診斷學指導教師唐發(fā)清20080501中南大學碩士學位論文摘要％。在30例鼻咽癌患者治療前和治療后1、2、3、4、5、6、7周及3月后復查9次EBVVCA／IGA檢測中，多數(shù)病例17／24治療后EBVVCA／IGA降低，部分患者6／24治療后EBVVCA／IGA變化不明顯。4通過分析EBVVCA／IGA、EBVDNA與鼻咽癌腫瘤大小相關性，發(fā)現(xiàn)EBVDNA拷貝數(shù)與鼻咽癌腫瘤體積有一定相關性。結論1將巢式PCR技術與熒光定量PCR技術結合，成功建立了血漿EBVDNA的檢測方法一一巢式熒光定量PCR。2通過動態(tài)監(jiān)測鼻咽癌患者治療過程中血漿EBVDNA拷貝數(shù)，明確了EBVDNA水平與鼻咽癌治療療效、腫瘤大小的關系。EBVDNA在一定程度上反映鼻咽癌腫瘤大小。3EBVVCA／IGA和EBVDNA拷貝數(shù)聯(lián)合用于鼻咽癌的早期篩查，具有一定的臨床價值。關鍵詞LMPL，EBVDNA，EBVVCA／IGA，EB病毒，鼻咽癌N

簡介：大連醫(yī)科大學碩士學位論文子宮頸癌篩查及認知現(xiàn)狀的調查分析姓名顧曉芬申請學位級別碩士專業(yè)流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學指導教師高曉虹20090601檢出率分別為212％、150％和O36％，早診率均達到90％以上，遠遠高于同期當?shù)蒯t(yī)院早診率；對CINII及以上的病例進行治療，早治率均達到75％以上，江西靖安的早治率已達L00％。對各年齡組CINII及以上的檢出率進行分析，結果發(fā)現(xiàn)深圳市以45～49歲年齡組為最高，其次為3034歲和4044歲年齡組；山西襄垣以50～54歲年齡組為最高，其次為45～49歲和35～39歲年齡組；江西靖安以30～34歲和55～59歲年齡組較高。除山西襄垣外，深圳和江西靖安現(xiàn)場研究對象對子宮頸癌的認知率及對篩查目的的認知率均超過70％，而且隨著文化程度的增加，認知率也隨之增加P005。對參加篩查的原因進行分析，結果顯示深圳現(xiàn)場以自愿參加為主，而山西、江西現(xiàn)場則以職能部門組織為主。三個現(xiàn)場的研究對象對篩查必要性的認識及篩查費用的支付意愿都很高，達到80％以上，但支付能力較低，且不愿意支付費用的原因以費用高和經(jīng)濟困難為主。結論①開展子宮頸癌的篩查可以提高早診率和早治率。②不同地區(qū)子宮頸癌高發(fā)年齡段不同。③受教育程度是影響子宮頸癌及其篩查目的認識水平的主要因素。④婦女對子宮頸癌篩查必要性的認識及篩‘查費用的支付意愿都很高，但支付能力較低，目前愿意支付的費用不能滿足篩查需求。關鍵詞子宮頸癌篩查早診早治認知意愿2

簡介：四川大學博士學位論文重組人內皮抑素腺病毒基因治療小鼠LEWIS肺癌的實驗研究姓名羅鋒申請學位級別博士專業(yè)腫瘤學指導教師魏于全20050401四川大學臨床醫(yī)學博士學位論文第一部分LEWIS肺癌縱隔轉移動物模型的建立方法探討研究生羅鋒導師魏于全教授中文摘要目的建立LEWIS肺癌縱隔轉移動物模型。方法小鼠LEWIS肺癌細胞體外培養(yǎng)，以5X104LEWIS肺癌細胞混懸液經(jīng)皮穿刺植入肺內，此穿刺植入腫瘤過程每只動物控制在LO秒內完成，手術死亡率5％。分期分批處死動物，解剖觀察測量稱重肺部腫瘤及縱隔轉移淋巴結。器官腫瘤組織切片HE染色組織病理學檢查。結果植入腫瘤后約7天肉眼可見動物肺內腫瘤原發(fā)結節(jié)，約14天肉眼可見動物縱隔腫瘤轉移性淋巴結結節(jié)，腫瘤病灶隨著時間延長而增大增多，1825天縱隔淋巴結轉移性結節(jié)增大融合，與縱隔組織器官心包大血管粘連。在第11，15，18，21天，肺內原發(fā)腫瘤體積分別為3．08±0．95MM3，29．62±8．17M3，152．3±36．11INT03，268．2±52．68NULL3。在第15，18，21天，縱隔轉移性淋巴結重量分別為18．4414．6MG，17938．9MG，36890．2ⅢG。病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)，在接種后的第15，18天肺內腫瘤細胞生長，接種后的第21，25天腫瘤結節(jié)中心出現(xiàn)中心性壞死與出血，在接種后14天出現(xiàn)縱隔淋巴結轉移灶。結論建立的LEWIS肺癌縱隔轉移動物模型與臨床上肺癌患者病情演變過程相似，提示該模型可作肺癌臨床生物學行為深入研究、腫瘤臨床新藥研究開發(fā)、腫瘤藥物治療療效評估的技術平臺。關鍵詞LEWIS肺癌，動物模型，縱隔轉移

簡介：目的原發(fā)性肝癌HEPATOCELLULARCARCINOMAHCC是世界第三大導致死亡的惡性腫瘤。HCC發(fā)生的其中一個危險因素是乙型肝炎病毒（HEPATITISBVIRUS，HBV）感染。目前全世界約有4億人感染HBV，中國約占13。HBV基因組由部分環(huán)狀的雙鏈DNA組成，全長約為32KB，基因組包含4個開放閱讀框架，分別為C、P、S和X區(qū)。乙型肝炎病毒X基因（HEPATITISBVIRUSXHBX）編碼154個氨基酸，在病毒的復制等方面發(fā)揮重要作用。大量的研究報道表明，HBX蛋白在HCC的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。作為一個多功能的調節(jié)因子，HBX能夠和細胞核內的轉錄因子相互作用，從而影響細胞的轉錄活性。此外，HBX還可涉及一些信號轉導通路，例如WNTΒCATENINRASMAPK，SAPKJNK，NFΚB，F(xiàn)AK等。WNTΒCATENIN信號通路調控著細胞的衰老、死亡、增殖、轉移，以及在決定胚胎形態(tài)等方面都發(fā)揮著重要的作用。大量的研究表明，WNT信號通路的異?；罨梢詤⑴c腫瘤的發(fā)生，例如肺癌、結腸癌等。以前也有研究表明，WNT信號通路的異?；罨部蓪е赂伟┑陌l(fā)生。在肝癌的發(fā)生中，除了WNTΒCATENIN信號通路組成部分的基因突變外，一些表觀遺傳修飾也可導致這條信號通路的異?；罨?。分泌卷曲相關蛋白SECRETEDFRIZZLEDRELATEDPROTEINS，SFRPS是一種WNT信號的拮抗因子。SFRPS家族共有5個分泌性糖蛋白家族成員，包括SFRP1～5，由約300個氨基酸殘基組成。有研究報道表明，由于SFRPS啟動子區(qū)甲基化導致其表達的下調，在HBV相關的HCC中發(fā)揮重要作用。相反，回復SFRP1的表達，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖和遷移能力。這些數(shù)據(jù)表明，SFRPS基因的表觀沉默表達，在由WNTΒCATENIN信號通路異常活化導致的HCC中發(fā)揮重要作用。也有研究報道表明，HBX也能夠激活WNTΒCATENIN這條信號通路，但是其在表觀沉默SFRPS從而導致肝癌的發(fā)生等方面，目前還未見相關的報道。本研究擬在細胞水平和腫瘤組織標本中觀察HBX對SFRPS的表觀調控，從而進一步研究HBX導致腫瘤發(fā)生的分子機制。方法收集臨床肝癌組織標本，提取癌組織DNA、RNA和總蛋白，通過RTPCR、WESTERNBLOT檢測腫瘤組織與癌旁組織中SFRP1和SFRP5的表達情況，進一步采用甲基化特異性PCRMETHYLATIONSPECIFICPCRMSP及亞硫酸鹽測序PCR（BISULFITESEQUENCINGPCRBSP），檢測肝癌組織中SFRP1、SFRP啟動子區(qū)的甲基化表達情況。同時觀察感染HBX的腫瘤細胞株SFRP1、SFRP5啟動子活性變化，進一步證實HBX能否調控SFRP1、SFRP5的表達。通過體外功能實驗研究回復SFRP1、SFRP5或干擾甲基化修飾酶DNMT1后肝癌細胞的增殖和遷移能力變化，探討HBX蛋白調控SFRP1、SFRP5的分子機制。結果我們在重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院收集到35例原發(fā)性肝癌組織標本，分別提取腫瘤和癌旁組織的總RNA、DNA、總蛋白，觀察到與癌旁組織相比，腫瘤組織WNT信號抑制分子SFRP1、SFRP5的表達明顯下調，甲基化特異性PCR以及亞硫酸鹽測序PCR實驗均表明腫瘤組織與癌旁組織相比，SFRP1和SFRP5啟動子區(qū)甲基化修飾顯著增高。體外構建成功含SFRP1和SFRP5區(qū)的啟動子截短突變報告質粒，采用雙熒光素酶報告基因法檢測，結果表明SFRP1、SFRP5啟動子區(qū)在轉錄起始位點400BP左右啟動子活性最強。感染HBX后，SFRP1、SFRP5的啟動子活性明顯低于對照組。在體外功能實驗中，平板克隆形成實驗、MTS實驗、BRDU摻入實驗、結晶紫實驗均可證實，穩(wěn)定表達HBX的肝癌細胞系，HBX蛋白可以明顯促進肝癌細胞增殖，并且干擾DNMT1或者回復SFRP1、SFRP5能夠抑制肝癌細胞的增殖作用。遷移實驗結果表明，HBX蛋白能夠增強肝癌細胞系HUH7細胞的遷移的能力，干擾DNMT1或者回復SFRP1和SFRP5的表達能夠抑制肝癌細胞的遷移能力。結論乙型肝炎病毒X蛋白通過降低SFRP1、SFRP5的啟動子活性，明顯下調WNT信號抑制分子SFRP1、SFRP5的表達。HBX促進腫瘤細胞的增殖和遷移能力與活化DNA甲基轉移酶下調SFRPS的表達進而活化WNT信號相關。

簡介：河北醫(yī)科大學碩士學位論文HTERT啟動子調控腺病毒介導的HSVTKGCV基因系統(tǒng)治療人膀胱癌的動物實驗研究姓名連文峰申請學位級別碩士專業(yè)外科學指導教師黎瑋20060301中文摘要水平上，從而可以增強基因治療的靶向性和安全性。利用HTERL、啟動子來調控病毒攜帶的目的基因，理論上可使病毒選擇性在端粒酶陽性的腫瘤細胞中表達目的基因。我們擬采用HTERT啟動子調控腺病毒介導的HSV_T剛GCV自殺基因系統(tǒng)，結合先天性缺乏胸腺的BALB／C裸鼠建立的人膀胱癌動物模型，給予重組腺病毒尾靜脈注射治療，觀察其在體內的治療效果、靶向性及安全性。方法裸鼠膀胱癌模型的建立和分組在小鼠右前肢腋窩皮下接種253J膀胱癌細胞懸液，觀察小鼠腫瘤生長情況。當腫瘤生長至直徑約為6MM時，對荷瘤裸鼠進行隨機分組，選用瘤體大小一致的裸鼠28只，分為4組，每組7只。A組為AD_HTEIMHSVT剛GCV組；B組為ADHTERTHSV_TK組；C組為GCV組；D組為對照組。AD_HTERTHSVTK經(jīng)尾靜脈注射荷瘤小鼠，GCV腹腔注射治療。ADHTERTHSV_TK／GCV治療后，觀察腫瘤體積、瘤重、腫瘤抑制率、腫瘤體積一時間曲線以及裸鼠生存期。通過常規(guī)病理切片觀察腫瘤破壞情況；通過TU惦L法、流式細胞學及透射電鏡進一步觀察腫瘤的凋亡情況，免疫組化染色檢測增殖細胞核抗原PCNA，測定增殖指數(shù)。結果ADHTERT_HSVT剛GCV治療組腹腔注射GCV后第7D，平均體積為28643MM310392MM3，明顯小于對照組49977MM31叭09MM3P005。直至實驗結束，腫瘤體積都明顯小于ADHⅡR1二HSVTK、GCV治療組和對照組。說明腫瘤生長速度明顯慢于對照組及AD_HTERL二HSVTK、GCV治療組。從移植瘤抑制率曲線可以看出，ADHTEIMHSVT列GCV組比AD_HTERT_HSVTK、GCV單