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簡介：背景和目的全球每年約5％10的成年人和200的兒童被流感病毒感染。病毒的不斷進化可致疫苗保護性下降甚至失效，產生抗藥毒株。除季節(jié)性流感，過去已發(fā)現(xiàn)大量禽流感感染人類并引起嚴重疾病如H5N1、H7N9、H10N8和H5N6等。兒童是感染流感的高危人群之一，且可傳染成人看護者，因此在兒童中監(jiān)測流感對防控流感有重要意義。本研究旨在監(jiān)測汕頭兒童中流感流行活動及H3N2和H7N9的分子變異特征和進化規(guī)律。方法使用RTPCR（逆轉錄聚合酶鏈反應）對ILI標本進行流感分型。在某些情況下，用MDCK細胞分離病毒，對比RTPCR與細胞分離法在流感檢出效率上的差異。選出陽性標本測序，分析分子變異特征和進化規(guī)律。比較不同流感患者的人口統(tǒng)計學和臨床特征。為了解H7N9的傳播途徑，還在本地菜市場活禽中開展了小規(guī)模采樣監(jiān)測。結果流感在汕頭幾乎全年流行。甲型H1N1和H3N2基本處于此消彼長的形態(tài)。2014年夏出現(xiàn)抗原性漂移的H3N2毒株。檢出一例兒童H7N9輕癥，和汕頭報導的4例重癥H7N9的病毒基因組各片段的進化距離都非常近。未出現(xiàn)人傳人的突變組合和神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥性的突變，但有優(yōu)先結合SAΑ26GAL受體的突變（HAT160A、Q226L和T221P），抗離子通道抑制劑類藥物的突變（M2S31N和V27I）和在小鼠感染中增強毒力的突變（M1N30D和T215A，NS1A42S，NA6973位缺失），然而能在小鼠感染中增強病毒復制能力的兩個氨基酸位點保守未變PB2E627和D701?；钋菔袌鐾瑫r檢出H7N9和H9N2?！?歲更易感染流感；結論1流感在汕頭幾乎全年流行。甲型H1N1和H3N2基本處于此消彼長。22014年夏發(fā)現(xiàn)抗原性漂移的H3N2毒株，對20142015和20152016年疫苗的保護性均具挑戰(zhàn)。3不同型流感患者在人口統(tǒng)計學和臨床特征上的某些顯著性差異，可為醫(yī)生診斷、治療流感提供參考。4在汕頭兒童普通流感監(jiān)測中成功篩查出輕癥病例，說明在兒科普通流感監(jiān)測中檢測H7N9十分必要。5人感染H7N9的威脅仍來自環(huán)境。H7N9和H9N2在禽類中仍在進行內部基因交換。但該時期汕頭的H7N9基因多樣性還比較穩(wěn)定。

簡介：遼寧師范大學碩士學位論文元認知干預技術對失眠癥干預效果的實驗研究姓名丁曉茜申請學位級別碩士專業(yè)應用心理學指導教師金洪源20090501元認知干預技術對失眠癥干預效果的實驗研究ABSTRACTOBJECTIVEINVESTIGATINGTHEEFFECTIVENESSOFAPPLYINGTHEMETACOGNITIONINTERVENTIONTECHNIQUEMITINTREATINGINSOMINAMETHODSAMULTIPLEBASELINESINGLESUBJECTDESIGNANDTHEREDUCTIONRATEOFPSQI’SSCOREWEREEMPLOYEDTOEXAMINETHETREATMENTEFFECTRESULTS111EIROVERALLSCORESOFPSQIARE17、14AND14INPREINTERVENTIONAND4、4ANDLINPOSTINTERVENTIONTHEREDUCTIONRATESOFOVERALLSCOREARE765％、714％AND929％THESYMPTOMSOFINSOMINAWEREVERIFIEDDURINGTHEBASELINEOBSERVATION，ANDTHEINDICATORSOFTHESESYMPTOMSWERECONSISTENTLYOBSERVEDAFTERINTERVENINGTHEFIRSTCLIENT’SYMPTOMIETHETIMEFROMLYINGINBEDTOFALLINGASLEEP，THEFREQUENCYOFTHISSYMPTOMREDUCEDDRAMATICALLYTHEOTHERSYMPTOMSALSOSHOWEDADECLININGTENDENCYAFTERTHEDIRECTINTERVENTIONTOEACHOFTHEOTHERCLIENT，THECORRESPONDINGSYMPTOMSWEREEITHERELIMINATEDORREDUCEDSIGNIFICANTLYCONCLUSIONTHESERESULTSSUGGESTEDTHATTHEMITISALLEFFECTIVEMETHODIN仃EATINGINSOMINAMADVANTAGESOFTHEMITANDLIMITATIONSOFTHISSTUDYWILLBEDISCUSSEDKEYWORDSINSOMINA；METACOGNITIONINTERVENTIONTECHNIQUE；MULTIPLEBASELINEDESIGN；INTERVENTIONSTUDYⅡ

簡介：蘇州大學碩士學位論文帕金森病血尿酸與認知功能障礙關系的研究分析姓名王曉君申請學位級別碩士專業(yè)神經(jīng)病學指導教師羅蔚鋒20090401帕金森病M尿酸與認知功能障礙關系的研究分析中文摘要方法選取蘇州大學附屬第二醫(yī)院2007年9月2009年3月診斷為PD的門診患者104例，對入選的PD患者進行認知功能評分和抑郁評分，用多重線性回歸方法對認知功能相關因素以及血尿酸與認知功能域的相關性進行分析。結果1PD患者的認知功能水平與受教育年限R2O604，P001、血尿酸水平R20713，P001呈正相關；與抑郁程度R20654，P001、年齡R2O694，P001和HY分期R20376，P001呈負相關；與性別、吸煙、身高體重指數(shù)BMI和I病程長短無相關性。2PD患者的血尿酸水平與記憶能力R20292，P0000和語言流暢能力R20236，P0006呈正相關。結論1PD患者的受教育程度、血尿酸水平、年齡、HY分期和抑郁嚴重程度會影響認知功能的改變。2對于PD患者，適當高的血尿酸水平有助于認知功能，包括記憶能力和語言流暢能力的改善。關鍵詞帕金森?。荒蛩?；記憶能力；語言流暢能力作者王曉君指導老師羅蔚鋒

簡介：點擊查看更多腺相關病毒載體介導BMP-2基因體內轉染兔退變椎間盤的研究.pdf精彩內容。

簡介：蘇州大學碩士學位論文裂解型基因重組腺病毒對人黑色素瘤細胞及小鼠肝癌抑瘤作用的實驗研究姓名周憶新申請學位級別碩士專業(yè)免疫學指導教師楊吉成20071001THEEXPERIMENTALSTUDYONONCOLYLICRECOMBINANTADENOVIRUSADEIAINHIBITA375INVITROANDH22TUBIOI“SROWTH，月V／VOALMR∞TTHEEXPERIMENTALSTUDYONONCOLYTICRECOMBINANTADENOVIRUSADE1AINHIBITA375／NVITROANDH22TUMORGROWTHINLYLVO●●ABSTRACTOBJECTIVETOCONSTRUCT111EONCOLYTICADENOVIRUSADE1AANDEXPLORETHEEFFECTOFE1AONA375CELLSITINHIBITH22TUMORGROWTHINVIVOANDENHANCETHEIMMUNEFUNCTIONOFBALB／CMICEMETHODSTHEPADTRACKCMVE1AWASCONSTRUCTEDWITHPUCMTE1ARECOMBINEDPLASMIDBYPCRASTEMPLATE，ENZYMEDIGESTIONANDLIGATIONTHEPADTRACKCMVRE1ALINEAREDBYPMELWASCOTRANSDUCTEDINTOBJ5183WITHPADEASYIANALYSISOFPCRAND。DNASEQUENCINGWASCARRIEDOUTTODEMONSTRATETHESEQUENCEOFTHEPLASMID111EPADEASY1PADTRACKCMVE1ARECOMBINEDADENOVIRUSVECTORWASLEAREDWITHPACIANDTHENTRANSFECTEDINTOQBI293ACELLSTHEADE1ARECOMBINEDADENOVIRUSWASOBTAINEDANDWASUSEDTOINFECTA375CELLSIDENTIFICATIONOFADE1AMRNABYIMPCRWASCARRIEDOUTTODEMONSTRATETHEEXPRESSIONOFADE1AINA375CELLSTHEEFFECTOFADE1AONA375WASSTUDIEDBYM巧FLOWCYTOMETRYANDSTUDYTHEEFFECTOFADE1AONH22TUMORGROWTHINVIVOANDTHEIMMUNEFUNCTIONOFBALB／CMICERESULTSTHERECOMBINEDONCOLYTICADENOVIRUSADELAWASOBTAINEDTHEONCOLYTICADENOVIRUSINHIBITH22ASCITICHEPATOMAOBVIOUSLYHAVENOSIDEEFFECTONIMMUNEORGANANDENHANCETHENUMBERSOFMONOCYTEANDNEUTROPHIL

簡介：肥胖OBESITY作為多種慢性疾病及惡性腫瘤的危險因素，已嚴重威脅著人類的身心健康。肥胖基因OBGENE及其編碼產物瘦素LEPTIN的發(fā)現(xiàn)，為肥胖在分子生物學水平的研究奠定了基礎。研究證實在大多數(shù)肥胖者和嚙齒類動物中存在著明顯的瘦素抵抗LEPTINRESITANCE，LR，即對瘦素減少體重信號反應能力降低。細胞因子信號轉導抑制因子3SUPPRESSOFCYTOKINESIGNALING3，SOCS3由瘦素誘導產生，是瘦素信號轉導的負反饋抑制因子，通過抑制瘦素信號轉導通路發(fā)揮作用。SOCS3是胰島素、生長激素等多種激素的抑制因子，在中樞抑制其表達可能影響其他激素發(fā)揮其正常生理功能。因此，本研究首先通過建立高脂飲食誘導的肥胖DIETINDUCEDOBESITY，DIO大鼠模型，檢測脂肪組織中SOCS3MRNA表達情況；然后，應用慢病毒載體LENTIVIRUSVECT介導的RNA干擾RNAINTERFERENCE，RNAI技術在體外進行DIO大鼠脂肪細胞SOCS3基因敲除，減少或阻斷肥胖大鼠脂肪細胞內SOCS3的表達，觀察其對脂肪細胞代謝的影響。材料與方法一、飲食誘導肥胖大鼠模型的建立及指標檢測一建立飲食誘導肥胖大鼠模型40只雄性WISTAR大鼠適應性飼養(yǎng)1W后，按體重隨機分為2組對照組7只喂飼普通基礎飼料，高脂組33只喂飼高脂飼料，高脂飼料含基礎飼料73％、豬油20％、酪蛋白7％。第8W末，按體重增量大于對照組體重增量均值加上1倍標準差作為肥胖標準，從高脂組中篩選出10只大鼠作為肥胖組，5只處死用于血脂及附睪周圍脂肪組織SOCS3MRNA指標檢測，5只用于大鼠原代脂肪基質細胞培養(yǎng)。實驗結束時，乙醚麻醉大鼠，腹主動脈采血，分離血清。二血脂的測定按試劑盒說明，用半自動生化分析儀測定血清中總膽固醇TOTALCHOLESTEROL，TC、甘油三酯TRIGLYCERIDE，TG含量。三脂肪組織SOCS3MRNA表達量測定按TRIZOL說明書操作步驟，提取100MG左右大鼠附睪周圍脂肪組織的總RNA。取總RNA量1ΜG，按TAKARARNAPCR試劑盒說明，進行RTPCR反應。取2ΜLCDNA為模板，以ΒACTIN作為內參對照。各指標反應條件相同，RTPCR反應條件為30℃10MIN，42℃30MIN，99℃5MIN，5℃5MIN。PCR反應條件94℃，2MIN預變性；擴增的35個循環(huán)包括變性94℃30S、退火56℃30S、延伸72℃1MIN。再72℃延伸10MIN。5ΜL目的基因產物，加預染液預染3MIN；2％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀拍照，以與內參對照ΒACTIN的比值作為目的基因表達的相對含量。二、大鼠原代脂肪基質細胞分離培養(yǎng)及成脂誘導分化無菌條件下，取肥胖組大鼠附睪周圍脂肪組織，去除血管和其他組織，PBS反復清洗。加入午血清白蛋白和II型膠原酶混合物消化。過250ΜM篩網(wǎng)，50G離心10MIN，200G離心10MIN。加紅細胞裂解液，室溫靜置5～10MIN，過25ΜM篩網(wǎng)，200G離心5MIN2次。加基礎培養(yǎng)基混懸后，接種到12孔板中。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。當原代培養(yǎng)的大鼠脂肪基質細胞長成單層后，用PBS洗2次，更換為誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，3D后，更換去除異丁基甲基黃嘌呤和羅格列酮的誘導分化培養(yǎng)基，隔日換液。10D后，油紅O染色鑒定脂肪細胞及分化率。三、SOCS3SHRNA慢病毒表達載體的構建慢病毒載體委托吉凱基因化學有限公司合成。四、慢病毒感染及瘦素處理肥胖組大鼠原代脂肪基質細胞誘導分化10D后，感染慢病毒，共分3組，每組4個復孔，分別為空白對照組CON組，陰性對照病毒組NC組，SOCS3SHRNA慢病毒組KD組。96H后熒光鏡檢觀察感染率。感染5D后，每組取2孔加大鼠重組瘦素處理6H。五、SOCS3、ACC和ACOMRNA表達量測定TRIZOL提取細胞總RNA，反轉錄成CDNA，PCR法擴增目的基因，SOCS3和GAPDH內參的退火溫度為56℃；ACC和ACO的退火溫度為50℃，其它步驟同前。六、統(tǒng)計分析實驗結果用X±S表示，用SPSS130統(tǒng)計軟件進行T檢驗和單因素方差分析，檢驗水準Α005。結果一、實驗期間大鼠體重變化喂飼高脂飼料前，兩組大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義P005，但1W后體重開始分化，此后，肥胖組大鼠體重一直高于對照組，至第8W末，肥胖組大鼠體重及體重增量與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義P005。二、第8W末大鼠血脂水平及脂肪組織SOCS3MRNA表達情況第8W末大鼠血清總膽固醇和甘油三酯水平，肥胖組顯著高于對照組P005。而附睪周圍脂肪組織中SOCS3MRNA表達水平肥胖組也高于對照組，灰度值分析結果顯示差異有統(tǒng)計學意義P005。三、大鼠原代脂肪基質細胞形態(tài)及成脂誘導分化剛接種的大鼠原代脂肪基質細胞呈圓形或類圓形。隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞變得細長，呈典型的成纖維細胞形，生長比較旺盛。經(jīng)成脂誘導分化劑誘導48H后細胞變圓，體積增大，胞內有脂滴形成。油紅O可將脂滴染成紅色，證明誘導所產生的細胞為脂肪細胞。計數(shù)分化率約為70％。四、慢病毒感染分化后的大鼠脂肪基質細胞感染72H后熒光鏡檢觀察，CON組無熒光表達，NC組和KD組有綠色熒光表達，感染率約80％。五、感染慢病毒后大鼠脂肪細胞SOCS3MRNA表達水平感染SOCS3SHRNA慢病毒的大鼠脂肪細胞KD組SOCS3MRNA表達水平低于感染陰性對照慢病毒的大鼠脂肪細胞NC組P005。SOCS3基因有效敲減率約為54％。六、各組細胞ACC和ACOMRNA表達水平瘦素處理后，KD組大鼠脂肪細胞ACCMRNA表達水平低于NC組P005；而ACOMRNA表達水平，瘦素處理后，KD組高于NC組P005。結論1、高脂飲食誘導的肥胖大鼠可能存在外周瘦素信號轉導通路抑制。2、SOCS3SHRNA慢病毒感染DIO大鼠脂肪細胞后，在一定程度上解除了SOCS3對脂肪細胞中瘦素信號轉導通路的抑制，緩解了脂肪細胞的瘦素抵抗。

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簡介：目的活細胞在刺激因子作用下細胞內蛋白質分子間的相互作用以及由此而產生的信號轉導是一個動態(tài)的過程，傳統(tǒng)的免疫共沉淀等研究方法不可能進行可視性的、實時動態(tài)觀察，因而可能丟失某些重要信息。因此，發(fā)展與建立一種能夠在活細胞水平實時動態(tài)觀察蛋白一蛋白之間相互作用的技術方法，對于研究生命過程細胞重要的病理生理反應及依賴的信號轉導機制具有重要的科學應用價值。熒光共振能量轉移術的優(yōu)勢在于能夠定位、實時動態(tài)檢測活細胞內蛋白質間相互作用或蛋白質構像的變化，已經(jīng)在生命科學領域研究生物大分子相互作用過程中顯示出了其極大的應用拓展?jié)摿?。本課題通過建立以寬場熒光顯微鏡為基礎的FRET測定技術平臺，研究嚴重急性呼吸綜合癥冠狀病毒刺突蛋白SPIKE，S蛋白介導免疫損傷的可能信號轉導機制。內容和方法一、寬場熒光顯微鏡下FRET穩(wěn)態(tài)熒光強度測定的技術平臺構建1、構建青色熒光蛋白CYANFLUESCENTPROTEIN，CFP和黃色熒光蛋白YELLOWFLLJESCENTPROTEIN，YFP的融合蛋白質粒，PCFPYFP，設置為FRET檢測陽性對照質粒；研究寬場熒光顯微鏡檢測FRET的圖像對齊及主要影響因素，推導FRET檢測中圖像對齊的數(shù)學模型，優(yōu)化FRET結果。2、分別用CFP和YFP標記雌激素受體ALPHAESTROGENRECEPTΑ，ERΑ構建PCFPER和PYFPER質粒，以探討不同比例供受體對FRKT檢測結果的影響。3、構建PECFPYFP和PEYFPCFP熒光報告質粒，作為快速構建FRET檢測的供受體熒光融合蛋白對的工具載體。二、應用FRET技術研究SARS冠狀病毒S蛋白介導的干擾素GAMMAINTERFERONGAMMA，IFN?？烧T導的信號通路關鍵信號分子，信號轉導和轉錄激活因子1SIGNALTRANSDTJCERACTIVATIONOFTRALQION1，STAT1的激活。1、構建作為FRET供受體對的分別表達STAT1和STAT1突變體STAT1701，即701位點突變使SH2功能域失活熒光融合蛋白的質粒PSTAT1CFP和PSTAT1YFP等；應用FRET技術檢測基礎狀態(tài)下活細胞內STAT1STAT1的相互作用及IFN或SARS冠狀病毒S蛋白刺激下STAT1激活構像的改變。2、應用電泳遷移率變動分析ELECTROPHETICMOBILITYSHIFTASSAY，EMSA和RTPCR方法進一步確證SARS冠狀病毒S蛋白對IFN?？烧T導的信號通路關鍵信號分子STAT1的激活，以及對STAT1同源二聚體轉錄激活子的重要靶基因干擾素調節(jié)因子1IFNREGULATEDFACT1，IRF1的轉錄激活影響。結果一、成功建立寬場熒光顯微鏡下穩(wěn)態(tài)熒光強度測定檢測FRET的技術平臺1、通過比較圖像對齊方法在FRET檢測中的應用，以及旋轉偏移對FRET結果的可能影響，推導了新的圖像對齊數(shù)學模型，使之不僅能夠校準水平偏移亦能夠校準旋轉偏移，經(jīng)圖像對齊后像素一像素解析的FRET結果明顯改善。2、探討了寬場熒光顯微鏡下FRET檢測的熒光滲漏及背景熒光的去除問題，建立了FRET效率檢測的程序與方法，成功進行了圖像標準化處理，經(jīng)陽性模型驗證表明表達CFPYFP融合蛋白陽性對照質粒轉染細胞后經(jīng)FRET測定計算后表現(xiàn)為強陽性，已知供受體熒光融合蛋白存在FRET關系的分別表達CFPER和YFPER的質粒共轉染細胞后FRET檢測為陽性，而僅表達熒光蛋白CFP或YFP的空載質粒共轉染細胞后FRET檢測計算為陰性。3、各種標準化FRET效率的方法都有一定的局限性，當供受體比例相似時，如分子內FRET，E描述效果最好，當比例相差較大時，N效果較好，F(xiàn)RETN不能很好的描述FRET效率。4、成功構建PECFPYFP和PEYFPCFPFRET載體。二、應用建立的寬場熒光顯微鏡FRET效率測定方法發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒S蛋白能夠模擬INFΓ激活STAT1信號分子，誘導干擾素可誘導的基因轉錄激活。1、熒光顯微鏡下可以觀察到轉染PSTAT1CFP或PSTAT1YFP細胞的熒光主要分布于細胞漿，細胞核僅有少量表達。S蛋白或INFΓ刺激后熒光轉移至細胞核。分別單轉PCFPSTAT1，PYFPSTAT1，PYFPSTAT1CFP，PCFPSTAT1YFP，PSTAT1701CFP細胞的熒光分布基態(tài)下主要定位于細胞漿，INFΓ刺激后熒光分布無明顯變化。2、共轉染PSTAT1CFP和PSTAT1YFP質粒的1611BE基態(tài)下細胞核與細胞漿的FRET效率檢測陽性，核漿FRET效率分布無明顯差異，INFΓ或S蛋白刺激后核內FRET效率降低而胞漿不變。共轉染PSTAT1701CFP和PSTAT1701YFP質粒的16HBE細胞基態(tài)下FRET效率檢測亦為陽性。相比之下，共轉染PCFPSTAT1和PYFPSTAT1質粒的16HBE細胞FRET效率檢測為陰性。3、EMSA與RTPCR實驗結果證實經(jīng)INFΓ刺激的的人支氣管上皮細胞HUMANBRONCHIALEPITHELIALCELL，16HBE細胞核蛋白顯著增強了與IRF1基因啟動子上的干擾素GAMMA激活序列IFNGAMMAACTIVATEDSEQUENCE，GASDNA基序的結合，誘導了IRF1基因的轉錄；共轉染PSTAT1CFP和PSTAT1YFP質粒的16HBE細胞核蛋白進一步增強了與GAS的結合，并相應地增加了IRF1基因的轉錄；共轉染表達STAT1突變體的PSTAT1701CFP和PSTAT1701YFP質粒細胞下調了IRF1基因的轉錄激活。結論1、成功建立寬場熒光顯微鏡下穩(wěn)態(tài)熒光強度測定檢測FRET效率的技術平臺，通過數(shù)學模型改良明顯改善像素像素解析的FRET結果，提高了FRET測定的準確性。2、STAT1C末端連接CFP或YFP的熒光融合蛋白能夠保持野生型STAT1生物學活性，F(xiàn)RET測定結果表明基態(tài)下細胞內非激活形式的STAT1能夠以同源二聚體的形式存在，INFΓ或S蛋白刺激下STAT1同源二聚體入核，并發(fā)生了激活形式的構像改變，進而誘導了靶基因IRF1的轉錄激活。研究發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒S蛋白能夠激活INFΓ激活的信號分子，誘導INF?？烧T導的免疫炎癥反應相關核心因子的轉錄激活。

簡介：兒童時期下呼吸道感染是慢性阻塞性肺疾病發(fā)病獨立的危險因素。下呼吸道感染的主要病原體是病毒，尤其是腺病毒。與其他病毒感染不同，腺病毒往往在急性期感染后形成潛伏感染狀態(tài)，病毒雖然停止復制但病毒DNA長期存在于宿主細胞內，并表達部分病毒蛋白，其中E1A蛋白是腺病毒潛伏感染后最主要表達的效應蛋白。COPD最主要的病理特征是累及肺組織和氣道的慢性炎癥，所涉及的發(fā)病機制主要包括炎癥機制、氧化抗氧化失衡、蛋白酶抗蛋白酶失衡以及凋亡機制，構建了腺病毒潛伏感染持續(xù)表達E1A蛋白的細胞模型，離體水平對E1A蛋白對細胞炎癥反應、細胞凋亡、氧化抗氧化平衡、以及生理濃度糖皮質激素抗炎作用的影響等方面進行了研究。探討腺病毒潛伏感染在COPD發(fā)病機制中的作用，為進一步揭示COPD發(fā)病機制、尋找有效的COPD防治方法打下堅實基礎。方法一、腺病毒E1A基因高效真核表達質粒的構建及穩(wěn)定表達E1A蛋白的大鼠肺泡上皮細胞株的構建目的基因E1A編碼序列用PCR方法獲得，模板為含有腺病毒C屬5型基因組25到1770核苷酸序列的質粒PNEOE1A，將擴增的E1A基因片段連接到PGEMTEASY載體上，酶切、測序鑒定正確后，亞克隆至高效真核表達質粒PCDNA、PEGFPC上構建重組質粒PCDNAE1A、PEGFPCE1A。最后對重組質粒進行酶切和測序鑒定。將構建成功的PCDNAE1A、PEGFPCE1A重組質粒及對照質粒經(jīng)脂質體轉染大鼠肺泡上皮細胞，通過G418抗性篩選和單克隆化操作最終獲得4個穩(wěn)定表達E1A蛋白的抗性細胞克隆，進一步用RCR、RTPCR、WESTERNBLOT及免疫組化的方法對E1A基因表達進行鑒定。細胞形態(tài)學觀察以及增殖曲線、流式細胞周期分析E1A蛋白對細胞形態(tài)學及增殖周期的影響。二、腺病毒E1A基因對大鼠肺泡上皮細胞炎癥因子的影響及其機制1、10M9LLPS和10PGLTNFΑ作用E1A陽性組細胞和對照組細胞，分別于刺激因素作用24小時后收集細胞上清和細胞懸液進行細胞因子IL6、TNFΑ、ICAM1蛋白水平的測定；并于刺激因素作用前、作用后3、6、12小時收集細胞MRNA進行RTPCR檢測IL6、TNFΑ、ICAM1MRNA水平的表達。2、將轉錄因子AP1、NFΚB熒光報道質粒分別轉染E1A陽性組和對照組細胞，在轉染12小時后分別加入刺激因素LPS、TNFΑ作用12小時后收集細胞檢測各組細胞的熒光素酶活性及細胞裂解液中蛋白濃度，用蛋白濃度較正測定的熒光素酶活性值，得到校正熒光素酶活性值。3、根據(jù)大鼠ICAM1基因上游調控序列設計AP1、NFΚB寡核苷酸探針，利用上述探針、競爭探針和大鼠肺泡上皮細胞核蛋白進行EMSA實驗，確定ICAM1基因上游調控區(qū)域的功能元件與轉錄因子的結合活性。4、利用轉錄因子NFКB抑制劑TPCK處理E1A陽性組和對照組細胞后，加入刺激因素LPS、TNFΑ作用24小時后收集細胞進行ICAM1蛋白表達的測定，明確轉錄因子NFКB在ICAM1基因表達中的作用。三、E1A蛋白對TNFΑ誘導下細胞凋亡的影響用HOECHEST熒光染色及PI、結合膜聯(lián)蛋白VFITC雙染法觀察30PGLTNFΑ作用E1A陽性組細胞和對照組細胞8小時后細胞的凋亡情況。四、腺病毒ELA蛋白對轉錄因子AP1、NFКB轉錄活性的影響及氧化抗氧化失衡對其的影響1、刺激因素LPS和TNFΑ作用E1A陽性組細胞和對照組細胞，分別于刺激因素作用前、作用后30分鐘、1小時、4小時收集細胞核蛋白進行轉錄因子AP1、NFКB活化蛋白表達的免疫印記檢測，同時收集細胞總蛋白對轉錄因子NFКB總蛋白表達進行免疫印記檢測。2、用抗氧化物質NAC以及GSH合成酶抑制劑BSO預處理E1A陽性組細胞及對照質粒轉染細胞后，再加入LPS和TNFΑ作用細胞4小時，收集細胞核蛋白進行轉錄因子NFКB活化蛋白表達的免疫印記檢測。五、腺病毒E1A蛋白對生理濃度的糖皮質激素抗炎作用的影響及其機制1、用生理濃度的糖皮質激素預處理CCL149細胞后在加入致炎因素LPS，ELISA法檢測炎性因子IL6蛋白表達的影響；2、用生理濃度下糖皮質激素、HDAC抑制劑TSA預處理CCL149細胞后再加入LPS，ELISA法檢測細胞IL6蛋白的表達；3、比色法檢測LPS、HDAC抑制劑以及生理濃度下糖皮質激素作用CCL149細胞后，細胞HDAC活性的變化；4、ELISA法檢測生理濃度的糖皮質激素對E1A組陽性細胞和對照組細胞在LPS誘導下IL6蛋白表達的影響；5、比色法檢測致炎因素LPS、HDAC抑制劑以及生理濃度下糖皮質激素對E1A陽性組細胞和對照細胞HDAC活性的影響。結果一、成功克隆出E1A基因完全編碼區(qū)基因序列，構建含E1A基因完全編碼區(qū)的重組質粒PCDNA－E1A、，PEGFPC－E1A。將重組質粒與對照質粒轉染CCL149細胞后經(jīng)G418抗性篩選，E1A組共得到94個抗性細胞克隆，其中有9個細胞克隆經(jīng)PCR檢測能擴增出1560BP的基因片段，進一步RTPCR檢測有4個細胞克隆能擴增出E1A基因486BP特異性片段，而對照質粒組細胞和正常大鼠肺泡上皮細胞均無特異性條帶顯示；4個RTPCR陽性的細胞克隆行免疫組化結果顯示E1A陽性的細胞克隆均在細胞核內出現(xiàn)棕黃色細胞染色，而對照質粒組細胞和正常大鼠肺泡上皮細胞均未見陽性染色；WESTERNBLOT結果顯示4個E1A陽性細胞克隆均出現(xiàn)大小約為45～48、50～52KDAE1A特異性的蛋白條帶，而對照質粒組與正常大鼠肺泡上皮細胞均未出現(xiàn)特異性蛋白條帶。因此穩(wěn)定表達E1A蛋白的大鼠肺泡上皮細胞株構建成功。通過細胞增殖曲線及流式細胞增殖周期的觀察發(fā)現(xiàn)與對照細胞相比E1A組細胞增殖時間明顯延長；細胞周期分析發(fā)現(xiàn)與對照質粒轉染細胞相比，E1A穩(wěn)定轉染細胞出現(xiàn)明顯的S期縮短、G期延長，細胞形態(tài)學變化表現(xiàn)為細胞生長趨向為集簇狀，細胞核增大，細胞體積變小。二、在刺激因素LPS、TNFΑ作用下，E1A陽性組與對照質粒組在細胞因子IL6、TNFΑ的MRNA、蛋白表達方面無明顯差別；而細胞因子ICAM1MRNA和蛋白表達在E1A組明顯高于對照組；轉錄因子熒光報道系統(tǒng)顯示在刺激因素作用前后轉錄因子AP1、NFКB轉錄活性在E1A組均明顯高于對照組；進一步作轉錄因子AP1、NFКB在ICAM1基因上游調控序列功能元件結合活性的EMSA，結果顯示與對照組相比，E1A組在刺激因素作用后NFКB與ICAM1基因上游調控元件結合活性明顯增高；而AP1與ICAM1基因上游調控元件結合活性無明顯變化。NFКB抑制劑TPCK能完全阻斷E1A上調ICAM1蛋白表達的作用。因此，腺病毒E1A蛋白上調ICAM1表達的機制主要是通過轉錄因子NFКB實現(xiàn)的。三、細胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)在30PGLTNFΑ作用下，E1A陽性組凋亡細胞明顯增多，與對照相比差別有統(tǒng)計學意義。四、免疫印記結果顯示刺激因素LPS、TNFΑ作用后，E1A陽性組細胞轉錄因子AP1核轉錄活性與對照質粒組相比，差別無明顯顯著性；而轉錄因子NFКB核轉錄活性在E1A陽性組明顯高于對照組；BSO處理細胞后能明顯增加E1A上調NFКB核轉錄活性的作用；抗氧化劑NAC能明顯抑制E1A上調NFКB核轉錄活性的作用；相對與對照質粒轉染組，E1A對NFКB總蛋白表達無明顯影響。因此，腺病毒E1A蛋白在不影響NFКB總蛋白表達的情況下能明顯上調轉錄因子NFКB轉錄活性，腺病毒E1A蛋白能明顯降低細胞對氧化抗氧化失衡的耐受性，活化NFКB轉錄活性的作用。五、生理濃度的糖皮質激素能明顯抑制CCL149細胞在LPS誘導下IL6蛋白的表達；HDAC抑制劑TSA能完全抑制糖皮質激素的抗炎作用。通過測定CCL149細胞HDAC活性顯示刺激因素LPS能顯著降低細胞HDAC活性，而生理濃度的糖皮質激素能恢復細胞HDAC的活性。證實生理濃度糖皮質激素有一定抗炎作用，而這一作用的發(fā)揮重要是通過HDAC來實現(xiàn)的；進一步檢測E1A陽性組與對照質粒組細胞HDAC活性，結果顯示兩組在各處理因素作用下，細胞HDAC活性無顯著差別，E1A蛋白對生理濃度糖皮質激素抗炎作用無明顯影響。結論1、腺病毒E1A蛋白能夠放大致炎因素誘導下炎癥因子ICAM1MRNA和蛋白水平的表達。E1A蛋白主要通過上調轉錄因子NFКB的轉錄活性，增加NFКB與ICAM1基因上游調控元件的結合來增加ICAM1基因的表達。2、E1A蛋白能夠增加細胞對致凋亡因素的敏感性，上調TNFΑ誘導下的細胞凋亡。3、降低細胞內抗氧化物質GSH能明顯增加E1A蛋白上調轉錄因子NFКB轉錄活化的作用；抗氧化劑NAC能明顯拮抗E1A蛋白上調轉錄因子NFКB轉錄活化的作用，提示腺病毒E1A蛋白能夠降低細胞對氧化抗氧化失衡的耐受性。因此，腺病毒E1A蛋白可能通過放大細胞炎癥反應、降低細胞對氧化抗氧化失衡的耐受性以及促進細胞凋亡等方面參與COPD的發(fā)生、發(fā)展。

簡介：Y954S52博臨床型同等學力在職申請學校代碼10246學號T02110572病毒感染與多發(fā)性硬化的臨床和實驗室研究院專姓系業(yè)名華山醫(yī)院神經(jīng)病學毛悅時指導教師旦堡墓麴援完成日期蘭竺篁蘭旦文學論次位Ⅳ一學縋亡衫士異均P005。6在腦脊液中所有病毒抗體／抗原的結果，三組均無統(tǒng)計學差異均P005?！窘Y論】1MS組與其他兩組比較，血清中HBV總感染率，HBSAB，HBEAG的陽性率和血清HBSAG，HBEAG，HBCAB同時陽性俗稱大三陽的比例顯著高，有統(tǒng)計學差異均P005。說明MS組HBV感染率高，部分病人病毒活躍復制。2MS組EBV的EAIGG抗體陽性率升高，與OND組和NND組比較，有統(tǒng)計學差異均P005。提示發(fā)作期的MS患者常有活動性的EBV感染。3MS組血清中HSVIIGM抗體陽性率明顯高于其他兩組均P005，提示大部分發(fā)作期MS患者有新近的HSVI感染或潛伏的HSV_I的重新活化。I關鍵詞L多發(fā)性硬化；乙型肝炎病毒；EB病毒人類皰疹病毒6；單純皰疹病毒I型丙型肝炎病毒第二部分合成病毒多肽誘導實驗性自身免疫性腦脊髓炎EE的研究一用生物信息學方法選擇病毒多肽抗原【目的L用生物信息學BIOINFORMATICS的方法檢索與多發(fā)性硬化發(fā)病可能相關的幾種常見病毒的氨基酸序列與神經(jīng)髓鞘主要成分一髓鞘堿性蛋白MYELINBASICPROTEIN，MBP是否有相同或相似的序列，并明確具體氨基酸順序，為分子模擬學說提供理論依據(jù)。I方法L選擇SWISSPROT蛋白質序列數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址為HTTP／／WWWEXPASYCH／SPROT／SPROTTOPHTML，NCBI蛋白質序列數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址為HTTP／／WWWNCBINLMNIHGOV／ENTREZ／QUERVFCGIDBPROTEIN。蛋白質序列同源性分析數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址為HTTP／／WWWNCBINLMNIHGOV／BLAST；HTTP／／USEXPASYORG／TOOLS／BLAST／。MHCII類分子結合位點預測HTTP／／WWWIMTECHRESIN／RAGHAVA／PROPRED／。選定大鼠、豚鼠和人的MBP作為比對序列?！窘Y果】通過綜合考慮，篩選出4種與多發(fā)性硬化發(fā)病最可能相關的病毒肽段。它們是乙型肝炎病毒多聚酶肽段，氨基酸序列為GCYGSLPQSHIIQKIKECFR；JC病毒大T抗原肽段，氨基酸序列為HICKGFQCFKKPRTPPPK；EB病毒DNA多聚酶肽段，氨基酸序列為TGGVY墅VKKHVHES；人類皰疹病毒6U70堿性核酸外切酶肽段，氨基酸序列為IVERETRGQSENPLWHALRR。二合成病毒多肽誘導實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型EAE免疫學分析的體外實驗I目的】研究4條合成病毒肽是否帶有與豚鼠MBP6886相似的抗原表位，即具有與MBP6886相似的免疫反應性抗原性。

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簡介：第一軍醫(yī)大學博士學位論文登革病毒檢測基因芯片的研制研究姓名肖維威申請學位級別博士專業(yè)生物化學與分子生物學指導教師馬文麗20040501POLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESISPAGE辯I悶旆鼽股械服電孫PBSPHOSPHATEBUFFEREDSALINE磷酸鹽緩沖液PCR蟄OLYMERASECHAINREACTION聚合酶鏈式反應DHPOWEROFHYDROGENPH值PMTPHOTOMUPLTIPLIERTUBE光電倍增管RD糌STRICTIONDISPLAY嫩制性顯示RNARIBONUCLEICACID授耱孩酸RNASERIBONUCLEASERNA酶RPMREVOLUTIONSPERMINUTE每分鐘轉數(shù)RTPCRREVERSETRANSCRIPDONPCR反轉意CPCRSSECOND秒SDSSODIUMDODECYLSULPHATE十二烷基磺酸鈉SNPSINGLENUCLEOTIDEPOL，ANORPHYSM單核螢酸多態(tài)性SSCSTANDARDSALINECIFRATE標準聹檬酸鏊綴滓滾TEMEDN，N，N，，N，TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINEN，N，N’，N’一四甲基己二胺TRISN。TRISHYDROXYMETHLAMINOMETHANEN一三羥甲基氨撼甲烷UUNIT肇經(jīng)XGAL5BROMO一4CHLORO3一INDOLYL一5。溪一4氯一3一嘮L嫌一B岱D。GALACTOSIDE，D半乳糖苷PGMICROGRAM微克蕊MICROLITER鐓秀2

簡介：H5N1亞型高致病性禽流感嚴重威脅著人類及動物的健康。1997年香港H5N1禽流感病毒傳播到人事件的發(fā)生，更突出顯示了禽流感防治的公共衛(wèi)生意義?，F(xiàn)有的禽流感診斷方法主要包括病毒分離法、RTPCR、NASBA、膠體金免疫層析技術等。每種診斷方法各有其優(yōu)點，但又受到幾個不利因素的限制，如成本高、處理周期長以及靈敏度低等，尤其在定量分析禽流感病毒含量及病毒亞型判定的即時、準確性方面尚需改進。本研究應用SPR生物傳感器實時監(jiān)測傳感器芯片表面發(fā)生的抗原抗體結合解離反應，具有快速、簡便、敏感、特異、成本低等特點，可作為現(xiàn)有禽流感診斷方法的有益補充，用于檢測采集樣品或雞胚尿囊液、細胞培養(yǎng)物中的禽流感病毒。本研究制備了一種檢測H5亞型流感病毒抗原的抗體芯片和一種檢測A型流感病毒抗原的抗體芯片，利用單通道單參數(shù)表面等離子體諧振生物傳感器對H5亞型禽流感病毒和A型流感病毒的快速檢測方法進行了研究，兩者都可以直接用于樣品的檢測。在快速檢測H5亞型流感病毒研究中，分析比較了四種不同的檢測方法的檢測效果，以期獲得最靈敏、快速的檢測方法，這四種方法分別為蛋白A固定抗體檢測法、競爭抑制法、抗體夾心檢測法和直接檢測法。對試驗結果分析比較發(fā)現(xiàn)將病毒樣品用1％TRITONX100在室溫條件下裂解90MIN后，采用直接檢測法較其它幾種方法更為快速。直接檢測法原理如下抗H5N1亞型流感病毒血凝素（HA）單克隆抗體固定在傳感器芯片表面以捕獲樣品中病毒抗原片段，通過監(jiān)測反應過程中芯片表面折射率的變化獲得相關抗原片段結合量數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行分析后判定樣品中檢測物存在與否及含量。通過直接檢測法確立的H5亞型流感病毒的檢測范圍為5NGML500NGML。對抗體芯片的特異性、穩(wěn)定性進行了研究，該抗體芯片對兩株H5N1亞型禽流感病毒具有特異的檢測效果，對雜蛋白無結合作用，與同為A型流感病毒的H9N2亞型無結合反應。在H5亞型流感病毒快速檢測方法建立基礎之上，本研究制備了檢測A型流感病毒的抗體芯片，并對A型流感病毒的快速檢測方法進行了初步的探索，證實A型流感病毒檢測芯片對A型流感病毒的高致病型H5亞型和我國高發(fā)型H9亞型均具有較高的特異性。

簡介：目的本研究擬用呼吸道合胞病毒合并肺炎克雷伯菌感染誘發(fā)SD大鼠引起肺炎，觀察SD大鼠肺組織病理變化，檢測TLR4通路相關因子的表達情況，初步探討其與TLR4NFΚB信號轉導通路的關系。方法60只雄性SD大鼠隨機分為四組對照組、RSV組、KP組及RSVKP組，每組各15只。通過滴鼻感染法處理各組SD大鼠，于第0、1、3、5、7D相同時間段測量其體重、肺指數(shù)（LI），HE染色觀察肺部病理變化，RTPCR檢測TLR4及NFΚB的MRNA表達情況，WESTERNBLOT檢測NFΚB蛋白質的表達豐度，ELISA檢測肺泡灌洗液中TNFΑ和IL1Β炎性因子的分泌量。結果（1）肺指數(shù)與正常對照組相比，RSV組、KP組和RSVKP組SD大鼠LI呈逐漸遞增趨勢，RSV組和KP組在感染后第3、5天升高，差異有統(tǒng)計學意義（P（2）肺組織病理正常對照組SD大鼠肺泡結構清楚，壁薄無充血，肺間質無炎癥細胞浸潤。RSV組和KP組在感染后第3天開始出現(xiàn)彌漫性肺泡間隔增厚與肺泡壁破壞，且均隨感染時間的延長，肺泡結構破壞逐漸加重。而RSVKP組從第1天開始肺組織就有炎性細胞浸潤，并且在感染后同一時期較RSV組和KP組更為嚴重。（3）MRNA轉錄水平正常對照組SD大鼠肺組織中TLR4MRNA、NFΚBMRNA表達很低；隨著感染時間的延長，RSV組、KP組和RSVKP組TLR4MRNA、NFΚBMRNA表達量逐漸增加，有時間依賴性。RSV組TLR4MRNA表達在感染后第5、7D升高，差異統(tǒng)計學意義（P（4）NFΚB蛋白表達正常對照組中SD大鼠肺組織中NFΚB蛋白水平表達量較低，而在RSV組、KP組和RSVKP組NFΚB蛋白隨著感染時間的延長表達不斷增加。RSV組在感染后第5天明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P（5）TNFΑ、IL1Β含量正常對照組中TNFΑ和IL1Β含量較低，而在RSV組、KP組和RSVKP組TNFΑ、IL1Β含量隨著感染時間點的延長逐漸增加，有時間依賴性。RSV組和KP組TNFΑ在感染后第5、7天明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（F9137P結論（1）通過滴鼻法建立RSV合并KP感染誘發(fā)SD大鼠引起肺炎的動物模型可行。（2）RSV和KP混合感染具有協(xié)同作用，加重肺部炎癥。（3）RSV合并KP感染可能通過TLR4NFΚB途徑誘導肺部防御細胞釋放細胞因子TNFΑ和IL1Β等。