1、目的：對于惡性度高的膀胱癌細胞，其表面的柯薩奇-腺病毒受體（CAR）表達極低，5型腺病毒有限的轉導效率難以發(fā)揮溶瘤效果。我們課題組通過基因改造變換病毒的親嗜性，即選用11型腺病毒纖毛結合5型腺病毒骨架，并將膀胱組織特異性啟動子尿路空斑蛋白2（UPII）和前列腺干細胞抗原增強子（PSCAE)的基序插入病毒復制早期基因E1A前，構建具有膀胱癌選擇性的不依賴于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A。觀察嵌合型腺病

2、毒對EJ和T24兩種膀胱癌細胞株的形態(tài)、增殖能力的影響，探求病毒的最適感染劑量，進一步對比觀察嵌合型腺病毒 Ad/F11-PSCAE-UPII-E1A和5型腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A對EJ和T24細胞轉導效率和溶瘤能力的差異，為膀胱癌基因治療提供新的選擇和實驗依據(jù)。
　　方法：將嵌合11型纖毛的5型腺病毒骨架Ad5/F11，與本室保存的穿梭質粒Rp-PSACE-UPII-E1A，在大腸桿菌BJ5183內(nèi)將同源區(qū)段替

3、換重組。在卡那霉素抗性條件下，篩選出陽性單克隆重組子菌落，抽提質粒后PCR擴增UPII、PSCAE和E1A基因，并用PacI和BsrGI酶切質粒，電泳檢測產(chǎn)物大小。挑取鑒定完全正確的重組腺病毒質粒，純化后設不同比例轉染HEK293細胞，觀察病毒包裝結果。提取第一代腺病毒基因組，經(jīng) PCR檢測各目的基因的正確性，然后以第一代病毒感染HEK293細胞大量擴增，純化病毒后采用TCID50法測定滴度。常規(guī)培養(yǎng)EJ和T24細胞，以HEK293為標

4、準，RT-PCR檢測兩種細胞表面CD46的相對表達量。CCK8測定嵌合型腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A在不同梯度的感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）下，對EJ細胞和T24細胞的溶瘤能力，取病毒感染最佳MOI，與5型腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A作比較，病毒干預8d后，測定EJ和T24兩種細胞的活力變化。
　　結果：腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A

5、構建成功，滴度為1×1010PFU/ml。RT-PCR數(shù)據(jù)顯示EJ和T24細胞的CD46表達明顯高于HEK293細胞。CCK8測定結果表明，以20～40 MOI病毒量干預EJ和T24細胞后，細胞存活率的下降速度最快。與Ad5-PSCAE-UPII-E1A相比，Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A對EJ和T24細胞的溶瘤作用較為顯著。感染8d后，Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A病毒干預組 EJ和 T24細胞的存活率分別

6、為19.6±3.48％和51.8±2.48%；Ad5-PSCAE-UPII-E1A病毒干預組EJ和T24細胞的存活率分別為33.38±2.54%和80.27±2.18%。
　　結論：膀胱選擇性的高滴度腺病毒Ad5/F11-PSCAE-UPII-E1A構建成功，能高效殺傷T24和EJ細胞，溶瘤能力優(yōu)于腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A，這與病毒識別受體的改變有關，提示增加病毒的轉導效率可直接強化病毒溶瘤效果，這為膀胱癌治療的