1、目的：構建攜帶人源化的綠色熒光蛋白(hrGFP。humanizedgreen fluorescentprotein)膀胱癌組織特異性報告基因腺病毒載體Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP，為檢測膀胱癌循環(huán)腫瘤細胞提供了一種新的檢測方法。
　　方法：根據(jù)圖譜選取BglII和 PmeI兩種限制性內切酶分別對pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和 pShuttle-PSCAE-UPII-E1A進行分步酶切

2、。pShuttle-CMV-IRES-hrGFP酶切后獲得 IRES-hrGFP目的片段。pShuttle-PSCAE-UPII-E1A酶切后獲得 PSCAE-UPII-E1A目的片段，對IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段進行膠回收。將回收得的兩個片段IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段使用T4連接酶連接,16°恒溫箱過夜，連接液轉化至DH5α感受態(tài)細胞中、涂板，16小時后選

3、取陽性克隆，過夜搖菌，用菌液聚合酶鏈反應（PCR）、基因測序（IRES-hrGFP片段）鑒定新構建的穿梭質粒 pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。將pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP用酶 PmeI線性化后,電擊法轉化到含pAdEasy的BJ5183感受態(tài)細胞，轉化、涂板后選取陽性克隆，過夜搖菌，重組后的質粒Ad-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP經過酶切

4、（PacI、BsphI）、菌液PCR鑒定正確后,通過脂質體lipfectamine2000轉染至包裝細胞HEK293，包裝成膀胱癌組織特異性報告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。
　　結果：pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和pShuttle-PSCAE-UPII-E1A經過BglII和PmeI酶切后膠回收目的片段，將兩個目的片段用T4連接酶連接，形成新的穿梭質粒pShuttle-P

5、SCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,新構建的穿梭質粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1 A-IRES-hrGFP經PCR鑒定和IRES-hrGFP基因測序鑒定，成功后利用細菌內同源重組法制備出組織特異性膀胱癌的腺病毒載體pAd-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP，經酶切和PCR鑒定后，通過脂質體轉染至HEK293，熒光顯微鏡觀察到 hrGFP基因的表達，包裝成報告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UP