1、草魚是我國(guó)特有的具有巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鯉科大型魚類，產(chǎn)量產(chǎn)值均位居我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類第一。同時(shí)，草魚也是能高效轉(zhuǎn)化植物成為優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白的魚種，被譽(yù)為"水中牛羊"，研究草魚腸道消化代謝功能基因相關(guān)特性將使我們從分子生物學(xué)水平上更客觀、更精確地了解草魚的營(yíng)養(yǎng)消化機(jī)理和特性，本文采用雌性草魚腸道為實(shí)驗(yàn)材料，采用非均一化的Oligo-dT引物定向克隆技術(shù)構(gòu)建了草魚腸道組織的cDNA文庫(kù)，結(jié)合目前廣泛應(yīng)用于基因功能和表達(dá)模式的分析研究的EST測(cè)序分析技

2、術(shù)，對(duì)具有時(shí)空性和組織特異性表達(dá)等功能基因特征進(jìn)行了聚類分析，并且同GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、查詢和注釋。結(jié)果顯示418條序列有相關(guān)同源性，其他的521(55.5％)條序列沒(méi)有明顯的同源性(E-value≥1.00E-10)，揭示出在這些ESTs中能夠發(fā)現(xiàn)新功能基因的相當(dāng)可能性。 利用TRlzol法抽提草魚腸道組織總RNA，經(jīng)過(guò)親和素順磁磁珠(SA-PMPS)法從總RNA中分離純化富含Poly(A)的mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成d

3、s cDNA，連接EcoR Ⅰ接頭，末端磷酸化，Xho Ⅰ消化，將雙末端黏性化的雙鏈ds cDNA經(jīng)過(guò)膠回收cDNA片段篩選收集大于500 bp的cDNA片段，加工后與pBluescript Ⅱ SK(+)Vector連接，經(jīng)電轉(zhuǎn)化入DH10B宿主菌，構(gòu)建cDNA.文庫(kù)，挑取陽(yáng)性克隆，做PCR檢測(cè)，然后根據(jù)電泳圖粗略鑒定插入片斷的大小及小片段率；將合格的cDNA文庫(kù)送檢。檢測(cè)文庫(kù)庫(kù)容量至少為2.3×10<'5>，重組率達(dá)95％，平均插入

4、片斷長(zhǎng)度大于1000 bp。大規(guī)模EST測(cè)序主要包括模板制備、測(cè)序反應(yīng)、序列識(shí)別等流程。模板制備采用半自動(dòng)化流水線方式，主要步驟包括：文庫(kù)鋪板培養(yǎng)，大量隨機(jī)挑取菌落(cDNA克隆)，細(xì)菌增殖，質(zhì)粒DNA提取，電泳鑒定等。測(cè)序及序列初步分析工作主要在北京華大基因研究中心完成。結(jié)果共進(jìn)行了1571個(gè)成功反應(yīng)，其中1411條ESTs長(zhǎng)度大于100bp，使用Cross-match軟件去掉EST中的低質(zhì)量序列、載體序列、重復(fù)序列等，使用Phrap

5、序列拼接軟件將測(cè)序得到的EST拼接成重疊群，初步拼接得到939個(gè)單基因簇(Unigene)，其中包括188個(gè)重疊群(Contigs)，751個(gè)單拷貝EST(Singletons)。將拼接得到的重疊群和單拷貝EST與GenBank非冗余蛋白庫(kù)比對(duì)并使用GO(Gene Ontology)分類的方法做功能注釋。GO分類是現(xiàn)在較常用的EST分類方法，除此之外，還進(jìn)行GC含量、密碼子使用頻率等分析。418個(gè)重疊群和單拷貝的ESTs中有195個(gè)可歸

6、屬于細(xì)胞組分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物學(xué)過(guò)程(Biological processs)三個(gè)大類，而其余223個(gè)重疊群和單拷貝EST則為未知功能的EST。絕大部分EST與營(yíng)養(yǎng)代謝、生理學(xué)過(guò)程、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、酶活性及細(xì)胞過(guò)程有關(guān)，少數(shù)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、信號(hào)傳導(dǎo)活性以及細(xì)胞分裂分化等功能有關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)草魚以及其他鯉科魚類的消化系統(tǒng)功能基因的篩選和發(fā)現(xiàn)具有指導(dǎo)意義。此外，草魚腸