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文檔簡介
1、本實驗的目的是研究PCDH8基因在卵巢癌中的表達水平及臨床意義,并對進一步的機制研究進行初步的探索。本實驗首先應用免疫組織化學方法及組織芯片技術檢測PCDH8蛋白在卵巢癌組織中的表達情況,發(fā)現PCDH8蛋白的表達強度與患者臨床特征及預后之間存在緊密的聯系,隨后我們在體內外實驗中證實PCDH8在卵巢癌中的作用,并且擬從臨床腫瘤組織標本、體外細胞系和體內移植瘤模型三個層面系統(tǒng)、全面的研究PCDH8在卵巢癌中發(fā)生發(fā)展的功能和調控機制,為PCD
2、H8作為卵巢癌精準治療靶點提供了一定的理論基礎。
第一部分 PCDH8在卵巢癌中的表達及其和臨床預后的關系
目的:
研究PCDH8蛋白在卵巢癌組織中的表達及其和臨床特征與預后的關系,初步探索PCDH8在卵巢癌疾病進展中的作用。
方法:
1.應用Western Blot方法檢測PCDH8蛋白在8對卵巢癌及對應癌旁組織中的表達情況,分析PCDH8在卵巢癌和正常組織的表達差異;
2.
3、應用免疫組織化學方法及組織芯片技術檢測PCDH8蛋白在卵巢癌組織中的表達情況,并且分析PCDH8蛋白表達強度與患者臨床特征及生存預后之間的關系。
3.數據應用SPSS23.0(SPSS軟件,美國IBM公司)進行統(tǒng)計分析。研究結果以均數±標準差表示,數值類變量比較采用配對或非配對t檢驗。臨床病理特征單因素分析采用卡方檢驗,將單因素中有統(tǒng)計學差異(P<0.05)的變量帶入多因素COX回歸分析模型進行多因素分析。生存分析應用Kapl
4、an-Meier法檢測并應用graphpad prism6.0繪制生存曲線,以上所有檢驗定義P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。
結果:
1.Western Blot方法檢測結果提示卵巢癌組織中的表達與癌旁對比,卵巢癌組織中PCDH8表達水平明顯下調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.PCDH8表達水平與卵巢癌臨床病理參數的單因素和多因素COX回歸分析結果提示:PCDH8表達水平與卵巢癌患者預后(P=0.0
5、29)、轉移(P=0.048)、FIGO分期(P=0.0065)、和復發(fā)(P=0.0011)明顯相關,而與年齡、CA-125表達無明顯相關;PCDH8的低表達提示卵巢癌預后不良(P<0.01),并且是影響卵巢癌患者總體生存的獨立風險因素。
3.Kaplan-Meier生存分析結果顯示PCDH8低表達的卵巢癌患者的生存時間明顯差于PCDH8高表達的患者(P<0.05),提示PCDH8的表達和卵巢癌患者的臨床預后密切相關。
6、 結論:
卵巢患者組織中PCDH8的表達水平和患者臨床惡性表型和生存預后密切相關,PCDH8可能參與了卵巢癌的疾病進程。
第二部分 PCDH8基因對卵巢癌細胞生物學行為的影響及其分子機制
目的:
探討PCDH8在卵巢癌增殖、侵襲和轉移中的調節(jié)作用及其分子機制,旨在從新的角度闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機制,為尋找新的卵巢癌治療靶點提供理論依據。
方法:
1.利用慢病毒技術在卵巢癌細胞
7、中過表達PCDH8基因;
2.分別利用RT-PCR、Westernblot檢測PCDH8基因在卵巢癌中的過表達效率;
3.采用劃痕修復實驗(Wound Healing assay),檢測PCDH8基因過表達后卵巢癌細胞的遷移能力變化情況。
4.采用細胞侵襲實驗(Transwell assay),檢測PCDH8基因過表達后卵巢癌細胞侵襲能力的變化情況。
5.采用克隆形成實驗(Colony Forma
8、tion)分析檢測PCDH8基因過表達后卵巢癌細胞克隆形成能力的影響。
6.應用基因芯片技術研究在卵巢癌細胞中PCDH8基因過表達后,細胞轉錄組mRNA基因表達譜變化情況,同時利用生物信息學進行GO分析、KEGG通路分析。
7.數據應用SPSS23.0(SPSS軟件,美國IBM公司)進行統(tǒng)計分析。研究結果以均數±標準差表示,數值類變量比較采用配對或非配對t檢驗。以上所有檢驗定義P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。
9、 結果:
1.經RT-PCR、Westernblot和免疫熒光技術檢測驗證,轉染PCDH8慢病毒的卵巢癌細胞中PCDH8基因表達水平顯著增高,提示PCDH8過表達的卵巢癌細胞構建成功;
2.增殖實驗結果提示:與對照組的卵巢癌細胞相比,PCDH8過表達的卵巢癌細胞的卵巢癌細胞的生長被顯著抑制,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);
3.細胞遷移實驗結果提示:經過48h遷移后,與對照組的卵巢癌細胞相比,PCDH8
10、過表達的卵巢癌細胞的劃痕遷移距離顯著減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
4.細胞侵襲實驗結果提示:與對照組的卵巢癌細胞相比,PCDH8過表達的卵巢癌細胞侵襲入下層小室的細胞數目明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
5.克隆形成實驗結果提示:與對照組的卵巢癌細胞相比,PCDH8過表達的卵巢癌細胞的克隆形成的數目明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
6.基因芯片分析結果發(fā)現差異表達基
11、因有112個(Fold chang≥2,P<0.05),其中基因表達增高,呈現上調趨勢者有48個,而基因表達降低,呈下調趨勢者有64個。
7.對這些差異表達基因進行生物信息學分析。差異基因的GO分析,差異表達基因主要集中在對細胞凋亡、上皮發(fā)育、多細胞生物大分子代謝等過程中。
結論:
PCDH8過表達后顯著抑制了卵巢癌細胞的增殖能力、遷移能力、侵襲能力和克隆形成能力,提示PCDH8在卵巢癌的發(fā)展中可能起到抑癌
12、基因的作用。
第三部分 PCDH8對卵巢癌細胞生物學行為影響的裸鼠體內研究
目的:
通過構建PCDH8穩(wěn)定過表達的卵巢癌細胞系,并皮下注射入裸鼠體內成瘤,觀察體內PCDH8對卵巢癌細胞生物學行為的影響。
方法:
1.將PCDH8穩(wěn)定過表達組(Lenti-PCDH8)和空病毒對照組(Lenti-mock)的卵巢癌細胞注入裸鼠皮下,構建卵巢癌移植瘤模型,在體內觀察PCDH8過表達對卵巢癌生物
13、學行為的影響。
2.觀察PCDH8穩(wěn)定過表達組(Lenti-PCDH8)和空病毒對照組(Lenti-mock)裸鼠腫瘤體積和重量的變化,應用活體成像技術檢測移植瘤熒光強度的變化,繪制生長曲線。
3.免疫組織化學技術檢測裸鼠腫瘤組織的PCDH8的表達。
4.數據應用SPSS23.0(SPSS軟件,美國IBM公司)進行統(tǒng)計分析。研究結果以均數±標準差表示,數值類變量比較采用配對或非配對t檢驗,以上所有檢驗定義P
14、<0.05認為有統(tǒng)計學意義。
結果:
1.裸鼠體內實驗結果顯示,轉染過表達PCDH8的裸鼠組比轉染空病毒組,腫瘤體積和重量減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.裸鼠體內實驗結果顯示,轉染過表達PCDH8的裸鼠組比轉染空病毒組,移植瘤熒光強度顯著減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
3.裸鼠體內實驗結果顯示,轉染過表達PCDH8的裸鼠組比轉染空病毒組,腫瘤細胞增殖速度降低(P<0.0
15、5)。
結論:
PCDH8過表達抑制卵巢癌裸鼠移植瘤模型的體內的增殖速度,進一步確認了體外實驗的結果,證實了PCDH8在卵巢癌的發(fā)展中可能起到抑癌基因的作用的功能。
全文結論:
1.PCDH8在卵巢癌中表達明顯降低。PCDH8的異常低表達和患者轉移、復發(fā)等臨床惡性表型密切相關,同時PCDH8高表達患者的生存時間明顯長于PCDH8低表達的患者,提示PCDH8在卵巢癌的疾病進展中可能起到抑癌基因的作用
16、,可成為惡性臨床表型預測和判斷預后的潛在靶點。
2.體外研究結果顯示:PCDH8過表達后,卵巢癌的增殖能力、遷移能力、侵襲能力以及克隆形成能力明顯下降;在體內研究中,PCDH8過表達對卵巢癌成瘤能力的抑制被進一步驗證。
3.本研究先后通過體外細胞株實驗以及裸鼠體內荷瘤實驗,發(fā)現卵巢癌組織中PCDH8基因的低表達,并初步其探究了在卵巢癌侵襲轉移中PCDH8基因的具體作用和可能的機制,為PCDH8作為卵巢癌精準治療靶點提
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