1、隨著轉基因技術的發(fā)展,目前在許多物種上都成功獲得了轉基因動物,但外源基因在轉基因動物中的表達效率依然是轉基因技術中的障礙之一。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式,調節(jié)著機體的許多生物學過程。發(fā)生在啟動子區(qū)域的甲基化修飾通常參與該基因在轉錄水平的表達調控。在轉基因動物中,外源基因及其啟動子的甲基化都可能影響著外源基因的表達。本實驗室在前期的研究中通過體細胞克隆,干細胞克隆和卵周隙注射法分別獲得轉增強型綠色熒光蛋白(enhanced

2、green fluorescent protein, eGFP)、成纖維細胞內生長因子5(fibroblast growth factor5,FGF5)的轉基因綿羊。本研究通過檢測外源基因 eGFP、FGF5編碼區(qū)及其啟動子區(qū)的甲基化水平,并對外源蛋白表達效率進行相關性分析。結果表明,干細胞克隆外源基因啟動子區(qū)的甲基化水平最高,其次是體細胞克隆,卵周隙注射法最低;而對于編碼區(qū)的甲基化水平則隨外源基因不同而存在差異,外源基因eGFP編碼區(qū)

3、的甲基化水平在卵周隙注射法中最高,其次是干細胞克隆;但外源基因FGF5編碼區(qū)甲基化水平卻在體細胞克隆最高。Western blot檢測外源基因的蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)外源基因蛋白的表達量同其啟動子區(qū)域的甲基化水平呈負相關性。結果提示不同的轉基因方法可能會影響外源基因的甲基化水平,從而影響到外源基因的表達。
　　納米材料可使吸附目的基因形成納米基因復合物,通過內吞或吞噬作用進入細胞質,屬于非病毒型基因載體系統(tǒng),具有易于制備和安全性高等特

4、點。本研究利用納米材料作為載體探索轉基因技術。首先克隆獲得綿羊細胞重編程因子SOX2的cDNA序列并構建表達載體pLEX-SOX2-GFP。利用MgCl2、AlCl3、NaOH三種化合物制備直徑約100 nm呈六邊形雙層片狀結構的Mg2Al-Cl-LDH納米顆粒。以納米顆粒 Mg2Al-Cl-LDH結合pLEX-SOX2-GFP轉染HEK293T,流式細胞儀檢測GFP熒光信號評估轉染效果。優(yōu)化后的轉染條件是:質粒DNA與LDH共孵育的時

5、間在15min是轉染效率最高(6.93％);質粒DNA與LDH的質量比為4:50時轉染率最高(11.17%)。納米材料濃度與轉染效率呈正比,但同細胞的存活率呈反比,在200μg/ml為最佳濃度,細胞存活率最高(87%),轉染后的培養(yǎng)時間24h時轉染率最好(17.4%)。轉染質粒在細胞內均有明顯的綠色熒光蛋白的表達,說明該轉染方法可靠,表達能力強。
　　總之,本研究發(fā)現(xiàn)轉基因動物中外源基因蛋白的表達量同其啟動子區(qū)域的甲基化水平呈負相