1、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)基因玉米外源基因檢測方法研究姓名：肖一爭申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：唐詠20070601沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要本研究以6種轉(zhuǎn)基因玉米(MON810、Btll、Btl76、T25、GA21和NK603)為試驗材料，研究適合的基因組DNA提取方法，建立和驗證了轉(zhuǎn)基因玉米定性PCR檢測方法，并進(jìn)一步對擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行克隆、測序和BLAST同源性分析，制備出轉(zhuǎn)基因玉米檢測陽性樣品。還利

2、用定性PCR檢測引物建立和優(yōu)化了復(fù)合PcR檢測體系，同時參考Kuntrudi等MQDAPCR文獻(xiàn)中設(shè)計的探針，將復(fù)合PCR和基因芯片結(jié)合起來，建立了高效、可靠的外源基因檢測方法。得到的結(jié)論如下：1、研究表明改良CTAB法提取的基因組DNA純度高、質(zhì)量好。用玉米內(nèi)參照基因引物擴(kuò)增改良CTAB法提取的基因組DNA，結(jié)果均為陽性，這能消除下游檢測出現(xiàn)假陰性結(jié)果。2、本研究對Kuntrudi等MQDAPCR文獻(xiàn)中設(shè)計的引物進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果表明

3、35S枷t、NoS—F瓜、BtllF／R、Btl76F／R、T25一F／R和MoN8lOF儂引物檢測結(jié)果穩(wěn)定，可以用于轉(zhuǎn)基因玉米的定性檢測，而GA21F瓜引物檢測結(jié)果不穩(wěn)定，本研究對其進(jìn)行了改進(jìn)，重新建立了穩(wěn)定的定性PCR檢測體系。3、本研究還通過查詢和收集轉(zhuǎn)基因玉米NK603外源基因的構(gòu)建信息，設(shè)計了NK603F／R結(jié)構(gòu)特異性引物，建立和優(yōu)化了轉(zhuǎn)基因玉米NK603定性PCR檢測方法。4、對8對定性PCR檢測引物擴(kuò)增得到的目的基因進(jìn)行回

4、收、克隆、測序與基因數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)這些基因的特異片段就是檢測的目標(biāo)，因此可以將插入這些基因片段的質(zhì)粒作為檢測工作中的陽性對照。5、本研究利用定性PCR檢測的引物，設(shè)計和優(yōu)化了復(fù)合PCR反應(yīng)體系，能同時在一個PCR反應(yīng)中最多擴(kuò)增出6種轉(zhuǎn)基因玉米的特異性片段。6、利用Kuntrudi等MQDAPCR文獻(xiàn)中設(shè)計的探針，將復(fù)合PCR和基因芯片結(jié)合起來，同時檢測6種轉(zhuǎn)基因玉米的8個外源基因元件，包括CaMV35S基因、NOS基因、MaizeDN