1、目的：本研究采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304為靶細(xì)胞，觀察鈉泵抑制劑哇巴因(ouabain)對(duì)細(xì)胞死亡、細(xì)胞連接、細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>和活性氧自由基(ROS)的影響；檢測(cè)哇巴因作用細(xì)胞前后鈉泵α1亞單位、β1 亞單位、VE-cadherin和Snail基因表達(dá)的改變，探討鈉泵抑制介導(dǎo)的細(xì)胞死亡特征和作用機(jī)制。 方法： (1)MTT比色法檢測(cè)哇巴因?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。 (2)倒置光顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察

2、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；Hoechst33342/PI雙熒光染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞死亡特征，區(qū)分凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞。 (3)激光共聚焦顯微鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>、活性氧自由基。 (4)瓊脂糖凝膠電泳分析凋亡細(xì)胞DNA片段。 (5)半定量RT-PCR.法檢測(cè)哇巴因?qū)︹c泵α1和β1亞單位mRNA的表達(dá)以及VE-cadherin、Snail基因mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)論： (1)哇巴因可明顯

3、抑制ECV304細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制作用呈現(xiàn)濃度一時(shí)間依賴性。 (2)不同濃度哇巴因?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞的作用不同：高濃度可短時(shí)間引起細(xì)胞壞死，而低濃度可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 (3)哇巴因作用后細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度增加、氧自由基含量升高。 (4)哇巴因能濃度－時(shí)間依賴性上調(diào)鈉泵α1亞單位和Snail基因的表達(dá)、下調(diào)β1亞單位和VE-cadherin基因表達(dá)；β1亞單位和VE-cadherin表達(dá)共同降低，同時(shí)Snail抑制V