1、缺血性心臟病是因冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病，嚴(yán)重危害著人類健康，從分子水平探索預(yù)防和治療缺血性心臟病的新策略有重要的意義。在心肌受損后，Notch信號(hào)通路在促進(jìn)心肌保護(hù)和損傷修復(fù)方面的功能十分明顯，而ROCK基因在調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用，因此我們推測(cè)在心肌細(xì)胞缺血缺氧背景下，Notch信號(hào)通路和ROCK基因在調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡過程中存在著特定的關(guān)聯(lián)。
　　 目的：(1)探討Notch信號(hào)通

2、路對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響；(2)初步探討缺氧損傷后Notch信號(hào)通路調(diào)控ROCK2基因表達(dá)的作用機(jī)制，進(jìn)而揭示心肌受損后Notch信號(hào)通路在調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡和損傷修復(fù)過程中的分子機(jī)制。
　　 方法：(1)RT-PCR擴(kuò)增編碼H9c2心肌細(xì)胞Notch1胞內(nèi)段(NICD)全長DNA序列，重組入pCMV-Tag2B質(zhì)粒表達(dá)載體中，酶切、測(cè)序鑒定。將H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分四組：pCMV-Tag2B-NICD組、p

3、CMV-Tag2B組、脂質(zhì)體組(Lipofectamine)和Control組，使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒于H9c2心肌細(xì)胞，Western blot檢測(cè)NICD表達(dá)情況；(2)對(duì)體外培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞進(jìn)行缺氧復(fù)氧(21 h/6 h)，模擬大鼠心肌缺血再灌注模型，將H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組(Control組)、缺氧/復(fù)氧組(H/R)、NICD轉(zhuǎn)染預(yù)處理組(NICD組)、NICD轉(zhuǎn)染預(yù)處理+缺氧/復(fù)

4、氧組(NICD+H/R組)、Notch信號(hào)通路特異性抑制劑γ-分泌酶抑制劑處理組(DAPT組)、γ-分泌酶抑制劑處理+缺氧/復(fù)氧組(DAPT+H/R組)。采用Annexin V/PI雙染色法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，western blot檢測(cè)胞內(nèi)NICD和ROCK2蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Thg2B-NICD，轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，western blot顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)

5、胞后NICD蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)；(2)與Control組相比，過表達(dá)NICD后，ROCK2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，H9c2心肌細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05)；抑制NICD后，ROCK2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，H9c2心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCMV-Tag2B-NICD；(2)缺氧/復(fù)氧處理后的H9c2心肌細(xì)胞中，Notch1蛋白表達(dá)升高，ROCK2