1、目前，大腸癌的發(fā)病機制同其它腫瘤一樣，癌基因、抑癌基因、凋亡相關基因、生長因子及受體的異常表達及細胞內信號傳導紊亂被認為與大腸癌的發(fā)生和轉移密切相關。表皮生長因子受體，是目前最受注目的腫瘤治療藥物的靶位。大量研究表明，表皮生長因子受體-2(epidermalgrowthfactoreceptor，HER-2)的酪氨酸激酶區(qū)域是調節(jié)腫瘤細胞增殖、侵襲、血管生成、轉移和凋亡信號通路的重要部分。表皮生長因子EGF與受體HER-2的結合導致受體

2、的二聚體化和胞內段磷酸化，進而引發(fā)一系列的級聯(lián)放大反應，從而調控和傳遞大腸癌的生物學行為的信號。研究發(fā)現(xiàn)HER-2在人大腸癌組織中過表達，且其表達水平與預后的惡性程度呈正相關，HER-2的抑制劑有望被開發(fā)成為治療大腸癌的新藥。 RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的轉錄后基因沉默機制(PTGS)，dsRNA經RNA沉默復合體(RISC)降解成21-23nt的小片段(siRNA)，并以其為模板，特定位點、特定間隔

3、降解與之序列互補的mRNA，目前已成功用于基因功能和信號傳遞系統(tǒng)上下游分子相互關系的研究。本研究擬通過采用RNAi技術，探討利用體外合成shRNA和構建質粒載體的方法是否能有效沉默大腸癌細胞HER-2基因表達，阻斷HER-2所介導的惡性生物學行為，從而為大腸癌的基因治療提供新策略。 目的: 探討采用RNAi技術是否能有效抑制大腸癌HT-29細胞株HER-2表達，以及HER-2基因表達抑制后，大腸癌HT-29細胞生物學特性

4、的改變，以期為腫瘤治療提供新的理論依據(jù)和藥物靶點。 材料與方法: 體外合成短發(fā)夾狀shRNA-HER-2單鏈，并通過退火、回收、質粒酶切、連接、轉化、挑克隆、提質粒、測序等步驟，構建和鑒定重組質粒載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA-HER-2，通過脂質體轉染HT-29細胞株。用western-blot法檢測shRNA對HER-2蛋白表達變化情況；用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色分析檢測細胞體外增殖率情況；通過DAP

5、I染色觀察干擾后的細胞凋亡情況；通過原位末端標記TUNEL法觀察細胞凋亡形態(tài)學改變。 結果: 成功構建針對HER-2基因的pGU6/GFP/Neo-shRNA-HER-2重組質粒，轉染大腸癌HT-29細胞，在綠色熒光激發(fā)波長下細胞顯示為綠色，轉染后熒光顯微鏡攝片證實轉染成功。Westernblot檢測到轉染重組質粒的實驗組與未轉染重組質粒的對照組比較，前者對HER-2蛋白表達有明顯抑制；MTT檢測的結果表明，重組質粒對H