1、靈芝(Ganoderma lucidum)是一種傳統(tǒng)藥用真菌，在我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥學中應用歷史悠久。被用于治療多種疾病，如肝炎、高血壓、高血脂、胃癌等?，F代藥理研究證明靈芝具有抗腫瘤、調節(jié)免疫、降血糖、抗衰老等藥理作用。在中藥現代化研究進程中，人們在靈芝中分離出其中一類重要的藥理活性物質并證實為三萜類化合物。
　　 作為次級代謝產物，三萜類化合物在真菌中是經由甲羥戊酸途徑后，形成兩個五碳單位異戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸。異戊二烯

2、焦磷酸異構酶處于甲羥戊酸途徑中的末端，催化無活性的異戊烯焦磷酸轉化為有活性的親核型異構體二甲基烯丙基焦磷酸，進而激活五碳化合物鏈的延伸反應，是萜類化合物合成過程中的一個重要的酶；而且它可能通過調節(jié)底物異戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸的比例來調節(jié)相關代謝終產物的流向。因此研究異戊二烯焦磷酸異構酶的表達特性，對于運用分子生物學的方法提高靈芝的藥用價值方面有著重要的意義。
　　 本文通過已報道過的其他物種的IDI1氨基酸序列，設計簡并

3、引物，PCR擴增得到該基因599 bp的特異片段；然后基于獲得的特異片段序列，設計特異性5’-SEFA引物，以靈芝菌絲體DNA為模板擴增該基因的5’端和啟動子區(qū)；通過3’-RACE的方法，以反轉錄cDNA為模板，擴增得到該基因的3’端和3UTR。對得到的序列進行拼接、比對分析后，設計引物，分別以靈芝的基因組DNA和cDNA為模板擴增得到異戊二烯焦磷酸異構酶基因(idi1)的基因組序列和cDNA全長序列?；蚪M全長為985 bp，cDNA

4、全長為759 bp，其編碼一個252個氨基酸組成的蛋白質。對靈芝異戊二烯焦磷酸異構酶基因的基因組序列和cDNA序列的對比分析表明，該基因由3個外顯子和2個內含子構成，它們的長度分別為59 bp(intronl)、167 bp(intron2)。將該基因轉入具有合成β-胡蘿卜素生物合成途徑的大腸桿菌TOP10 F’，發(fā)現該基因的導入使原菌株中的β-胡蘿卜素生物積累顯著增加，通過這種方法進一步證明了我們得到的基因是有功能的。
　　

5、通過軟件分析，預測靈芝IDI1蛋白質分子量為28.70777kD，等電點為5.36。利用Plant care網站對得到靈芝idi1基因及1202bp啟動子序列預測分析，結果顯示：靈芝idi1基因的啟動子區(qū)域含有17個CAAT box、1個推定的TATA box等典型的真核生物啟動子元件.另外，還含2個Sp1元件、1個ATC-motif、1個Box4(光調控順時作用元件)，1個LTR元件(低溫響應元件)、1個Box-W1(真菌激發(fā)子響應元

6、件)、2個auxin-responsiveelement(茁長素響應元件)、1個MYBHv1結合位點、4個CGTCA-motif、2個TGACG-motif(茉莉酸甲酯響應元件)、2個MBS(與干旱誘導有關的MYB結合位點)等。
　　 為了研究idi1基因在不同發(fā)育時期基因的表達水平，本實驗采用半定量RT-PCR的方法考查了該基因的不同發(fā)育階段mRNA水平，結果顯示idi1基因在原基時期表達量最高；并用相同的方法對254μM茉莉