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簡介：登革熱病毒DENGUEVIRUS是一種能夠引發(fā)登革熱疾病的黃病毒屬病毒，病患區(qū)主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，世界上五分之二的人口將面臨罹患登革熱的危險。全球每年有超過5000萬的登革熱感染病例，其中50萬例發(fā)展為登革出血熱DHF和登革休克綜合征DSS，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡。由于登革熱較高的死亡率，它已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病之一。遺憾的是，這種疾病在預(yù)防免疫方面，目前尚未研制出有效的疫苗。在疾病治療方面，也未能有針對性的藥物問世。因此，找到有效抗登革熱病毒的抑制劑已經(jīng)迫在眉睫。登革熱病毒是單股正鏈RNA病毒，可翻譯成三種結(jié)構(gòu)蛋白核蛋白C，膜結(jié)合蛋白PRM和包膜蛋白E和七種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5。其中NS3蛋白具有絲氨酸蛋白酶的作用，與NS2B蛋白形成異源二聚體復(fù)合物，該復(fù)合物在病毒的多聚蛋白轉(zhuǎn)錄和水解過程中發(fā)揮重要作用。通過抑制蛋白酶復(fù)合物的活性我們可以阻斷病毒的生長和繁殖。隨著2006年第一個活性登革熱絲氨酸蛋白酶的單晶衍射結(jié)構(gòu)的測定和2011年四肽醛抑制劑BZNLELYSARGARGH與登革熱絲氨酸蛋白酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的解析，設(shè)計結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的絲氨酸蛋白酶抑制劑已經(jīng)具備了先決條件。本文以登革熱絲氨酸蛋白酶為靶點，基于蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)的特點，參考已報道的四肽醛BZNLELYSARGARGHKI58ΜM的結(jié)構(gòu)，以三肽醛LYSBOCARGPBFLYSCBZH為母核結(jié)構(gòu)，通過選擇不同的LINKER構(gòu)建一系列環(huán)肽小分子化合物，合理設(shè)計優(yōu)化后進(jìn)行了生物活性篩選。其中合成的目標(biāo)化合物Ⅲ和X對DENV2絲氨酸蛋白酶的抑制率均超過50％，目標(biāo)化合物Ⅲ的抑制率目標(biāo)化合物Ⅲ的IC50值為35ΜM，EC50值為33ΜM，為設(shè)計針對絲氨酸蛋白酶NS2BNS3PRO為靶點的抗登革熱病毒的抑制劑提供了一定的參考依據(jù)。

簡介：第一部分EBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及殺傷效果鑒定目的研究EB病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞EBVCTL體外誘導(dǎo)和擴增培養(yǎng)的方法，并檢測其殺傷的效果。方法采集EBV血清抗體陽性的6例正常供體的外周血單個核細(xì)胞（PBMNC），用EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞系（BLCL）作為抗原遞呈細(xì)胞及抗原刺激劑經(jīng)輻照滅活后不斷刺激培養(yǎng)自體PBMNC，誘導(dǎo)產(chǎn)生EBVCTL，并將其擴增培養(yǎng)；采用流式細(xì)胞儀鑒定其免疫表型；然后檢測不同效靶細(xì)胞比例條件下EBVCTL對自體BLCL、自體植物血凝素培養(yǎng)的B淋巴母細(xì)胞（PHABLAST）、HLA不合供體的BLCL（ALLOBLCL）、K562細(xì)胞株的殺傷效果。結(jié)果6例EBV血清抗體陽性正常供體來源的PBMNC在體外成功篩選并擴增培養(yǎng)了EBVCTL，擴增效率為PBMNC數(shù)的186550倍。刺激10次培養(yǎng)后的EBVCTL對自體BLCL在201，101，51三種效靶細(xì)胞比例條件下特異性殺傷效率的平均值分別為594、432、290；對PHABLAST、ALLOBLCL、K562的非特異性殺傷率在上述三種效靶細(xì)胞比例下平均值依次為71、94、103（P﹤005），66、83、81（P﹤005），54、73、63（P﹤005）。結(jié)論EBVCTL能有效在體外篩選培養(yǎng)并擴增，并能有效殺傷HLA相合的BLCL；可望成為EBV相關(guān)性移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾病的過繼免疫治療的有效方法。第二部分異基因造血干細(xì)胞移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾病的臨床分析目的提高對異基因造血干細(xì)胞移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾病（PTLD）的認(rèn)識，探討其有效的治療策略。方法回顧性分析2006年1月至2011年12月我院行異基因造血干細(xì)胞移植的524例病例，其中同胞全相合移植299例，無關(guān)供體相合移植149例，親緣半相合移植51例，臍血移植25例。結(jié)果根據(jù)臨床表現(xiàn)及病理結(jié)果共確診7例PTLD；在上述四種移植類型中PTLD發(fā)病率依次為03（1299），27（4149），20（151），40（125）；后三者發(fā)病率均高于同胞全相合移植組（P044）；在預(yù)處理應(yīng)用抗胸腺細(xì)胞球蛋白（ATG）的患者中發(fā)病率為27（6225），明顯高于無ATG者（1299P046）。7例PTLD臨床表現(xiàn)特征主要分為兩類6例發(fā)生在移植后2至8個月，播散性起病，正規(guī)經(jīng)驗性抗感染治療無效的發(fā)熱，淋巴結(jié)進(jìn)行性腫大，血象三系進(jìn)行性下降，EB病毒血癥，病情迅速進(jìn)展，短期內(nèi)出現(xiàn)多臟器功能不全；1例發(fā)生在移植后18月，以頜下淋巴結(jié)進(jìn)行性腫大局限性起病，EBVDNA檢測陰性，病程相對緩和。病理類型6例為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，1例為小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤。7例中4例給予含利妥昔單抗方案治療，2例恢復(fù)，2例死于PTLD進(jìn)展；1例給予供者淋巴細(xì)胞輸注后恢復(fù)；其余2例對抗病毒對癥支持治療無效死亡。結(jié)論PTLD是一組異質(zhì)性淋巴細(xì)胞增殖性疾病，盡早診斷，及時采用有效措施治療有望改善其預(yù)后。

簡介：目的探討人類免疫缺陷病毒HUMANIMMUNODEFICIENCYVIRUS，HIV感染者在急性期的臨床特點以及接受抗病毒治療ANTIRETROVIRALTHERAPY，ART48周過程中的免疫學(xué)和病毒學(xué)應(yīng)答變化，并進(jìn)一步分析艾生特強化治療和雷公藤多甙片TRIPTERYGIUMWILFDIIHOOKF，TWHF對病毒儲存庫和免疫激活是否有影響，從而尋找對急性期HIV感染者的臨床干預(yù)措施，有助于深化對早期強化治療的認(rèn)識，并為達(dá)到艾滋病功能性治愈提供一定的理論依據(jù)。方法1橫斷面研究招募44例未接受過ART的HIV急性期感染者，采集外周靜脈血標(biāo)本，收集臨床流行病學(xué)資料，描述急性期的臨床癥狀，分析CD4T及CD8T細(xì)胞計數(shù)、CD4CD8比值、異常免疫激活、血漿病毒載量、感染途徑、感染時間等指標(biāo)之間的相關(guān)性。2隊列研究篩選27例急性期HIV感染者，根據(jù)CD4T細(xì)胞計數(shù)進(jìn)行1∶1匹配原則選取27例慢性期感染者作為對照，規(guī)律ART并于基線、治療后4、12、24、36、48周進(jìn)行隨訪，觀察啟動ART后兩組人群在CD4T細(xì)胞計數(shù)、CD4CD8比值、血漿病毒載量和CD8T細(xì)胞上HLADR、CD38表達(dá)水平的動態(tài)改變。進(jìn)一步將27例急性期HIV感染者根據(jù)接受ART方案的不同分為三個亞組，第一組為11例患者接受含艾生特RALTEGRAVIR，RAL的ART，并于ART24周時加用TWHF第二組為10例患者僅接受四聯(lián)強化ART第三組為6例患者接受標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)ART，分別在基線、治療4、8、12、24、36及48周共7個時間點進(jìn)行規(guī)律隨訪。觀察三組人群CD4T細(xì)胞計數(shù)、病毒載量及CD8T細(xì)胞上HLADR、CD38表達(dá)水平的動態(tài)改變。3隊列研究分別從上述隊列中篩選出16例急性期和慢性期初治HIV感染者，分別檢測基線、4、12、24及48周共5個時間點PBMC中的HIVDNA的動態(tài)變化，并分析與CD4T細(xì)胞計數(shù)、血漿病毒載量及CD8T細(xì)胞上HLADR、CD38表達(dá)水平的相關(guān)性。進(jìn)一步分析TWHF組（6例）、TWHF組（4例）和對照組（6例）三組人群中急性期感染者在上述5個時間點的HIVDNA的動態(tài)變化是否有差異。結(jié)果1橫斷面研究44例急性期HIV感染者最常見的癥狀和體征包括發(fā)熱28例636％、頸部淋巴結(jié)腫大23例523％、皮膚黏膜損害8例182％、腹瀉9例205％、咽痛、咳嗽各4例91％等少見首診癥狀和體征包括1例23％格林巴利綜合征、1例23％上臂蜂窩織炎、1例23％頭痛嘔吐、1例23％肛周膿腫、1例23％血小板減少。其中7例159％患者無明顯癥狀。其中32例患者727％可以明確具體感染時間，平均為85IQR51，118天，25例568％出現(xiàn)了淋巴細(xì)胞比例升高，CD4T細(xì)胞計數(shù)中位數(shù)為413ULIQR359UL，620UL，CD8T細(xì)胞計數(shù)中位數(shù)1521ULIQR1054UL，2226UL，最大值高達(dá)7984UL，CD4CD8平均為029015，037，其中42例955％患者呈現(xiàn)明顯的倒置現(xiàn)象。血漿病毒載量中位數(shù)為489LG拷貝MLIQR459LG拷貝ML，543LG拷貝ML。CD8T細(xì)胞表面的HLADR和CD38表達(dá)比例分別為744％±162％和847％±125％。CD4T細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計數(shù)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系R049，P0001，CD8T細(xì)胞的HLADR和CD38表達(dá)比例與血漿病毒載量有顯著的正相關(guān)趨勢R043，P0005R050P00008。2隊列研究27例急性期和27例慢性期HIV感染者經(jīng)過48周ART，血漿病毒載量分別降低了368LG拷貝ML和332LG拷貝ML，兩組CD4T細(xì)胞計數(shù)分別增長了223UL和121ULP0032，CD8T細(xì)胞計數(shù)分別減少1102UL和271ULP0004。ART48周時，兩組CD4T細(xì)胞計數(shù)及比例、CD8T細(xì)胞計數(shù)及比例和CD4CD8比值大于1的患者所占的比例無統(tǒng)計學(xué)差異P＞005。兩組CD8T細(xì)胞的HLADR表達(dá)比例分別降低489％和354％，CD38表達(dá)比例分別降低451％和223％，發(fā)現(xiàn)AHI組的CD38表達(dá)比例變化量明顯高于CHI組P0006，而兩組的HLADR表達(dá)比例無統(tǒng)計學(xué)差異P0081。在TWHF組、TWHF組和對照組中，強化治療組的血漿病毒載量的下降速率明顯快于對照組P0019，CD4T細(xì)胞計數(shù)在48周內(nèi)的變化量分別151UL、227UL、193ULP057，CD8T細(xì)胞計數(shù)變化量分別為1527UL、1112UL1550ULP074，三組人群之間HLADR和CD38表達(dá)比例均無統(tǒng)計學(xué)差異P＞005。3隊列研究基線時，AHI組和CHI組PBMC中HIVDNA分別為211181，245和222205，254LG拷貝106PBMC，P057，CHI組HIVDNA與血漿病毒載量呈顯著正相關(guān)關(guān)系P0026，R005，AHI組未發(fā)現(xiàn)兩者之間的相關(guān)性。規(guī)律ART后，兩組人群平均HIVDNA含量均呈下降趨勢，但各個時間點之間亦無明顯統(tǒng)計學(xué)差異P＞005。治療48周時，TWHF組、TWHF組和對照組的HIVDNA分別為117006，125、177086，208和111038，135拷貝106PBMC，三組人群之間亦無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論HIV急性期感染者常見臨床表現(xiàn)是發(fā)熱、頸部淋巴結(jié)腫大、皮疹及腹瀉CD8T細(xì)胞計數(shù)顯著升高，CD4CD8倒置明顯和異常升高免疫激活是急性期的特征性表現(xiàn)，病毒載量和T細(xì)胞激活亞群檢測，尤其是CD4CD8比值有助于早期診斷急性期HIV感染。相比慢性期，對急性期HIV感染者進(jìn)行早期ART治療，不僅可以早期將病毒載量控制在檢測下限以下，而且可以更顯著降低CD8T上CD38和HLADR的表達(dá)，艾生特強化治療可以快速降低病毒載量，但不能影響機體的免疫學(xué)的應(yīng)答。從病毒儲存庫方面分析發(fā)現(xiàn)，病毒儲存庫在急性期的早期即開始建立，急性期和慢性期病毒載量和HIVDNA在治療后衰減呈正相關(guān)，說明任何階段抗病毒治療都可以起到減少病毒儲藏庫的作用。急性期患者接受雷公藤多甙聯(lián)合艾生特強化治療48周，觀測到PBMC中HIV1DNA的含量呈降低的變化趨勢。

簡介：目的研究維持性血液透析患者丙型肝炎病毒HCV感染的血清學(xué)診斷方法探討抗HCV聯(lián)合HCVRNA檢測在維持性血液透析患者HCV感染早期診斷中的意義以期獲得維持性血液透析患者HCV感染早期診斷的可靠方法并明確深圳市第二人民醫(yī)院血液透析中心患者丙型肝炎病毒感染的現(xiàn)況。方法選擇深圳市第二人民醫(yī)院血液透析中心183例維持性血液透析患者為研究對象分別使用不同HCV抗體試劑盒檢測抗HCV使用TMA法定性檢測HCVRNA熒光定量PCR法定量檢測HCVRNA比較不同產(chǎn)品及診斷方法對HCV的檢出率評價ALT變化與HCVRNA載量以及抗HCVSCO值與HCVRNA載量的關(guān)系。結(jié)果兩種不同產(chǎn)品國產(chǎn)試劑和進(jìn)口試劑對抗HCV檢測結(jié)果一致在本中心183例維持性血液透析患者中檢出抗HCV陽性患者13例檢出率為71％兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義P1000TMA法定性檢測HCVRNA陽性16例檢出率為87而免疫熒光定量PCR法檢測HCVRNA陽性10例檢出率為55兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義Χ287537P0000HCVRNA定性檢測比檢測抗HCV的檢出率高兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義Χ281531P0000聯(lián)合檢測抗HCV和HCVRNA定性檢測結(jié)果HCV陽性共19例檢出率為104與單獨檢測抗HCVP0031相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義但與單獨定性檢測HCVRNAP0250比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HCVRNA的載量和ALT的變化無相關(guān)性R0189P0536抗HCV初篩的SCO值與HCVRNA載量無相關(guān)性R0174P0569。深圳市第二人民醫(yī)院血液透析中心患者丙型肝炎病毒感染率為104高于獻(xiàn)血人群Χ218857P0000。結(jié)論本研究結(jié)果顯示HCVRNA定性檢測較抗HCV檢測能縮短維持性血液透析患者HCV感染后檢出的“窗口期”有利于早期診斷。HCVRNA定性檢測能較臨床現(xiàn)行的HCVRNA免疫熒光定量檢測顯著提高HCV感染的檢出率。聯(lián)合檢測抗HCV及HCVRNA定性檢測既能縮短HCV感染檢出的“窗口期”也能顯著提高HCV感染的檢出率可避免漏檢處于血清轉(zhuǎn)換期或慢性病毒攜帶或既往感染的“隱性”患者值得臨床推廣應(yīng)用。ALT的變化和HCV載量無明顯相關(guān)性在血液透析患者中輔助早期診斷HCV感染的作用較小。

簡介：河北醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文實驗性癲癇大鼠認(rèn)知功能障礙的機制探討及尼莫地平的影響姓名王佩申請學(xué)位級別博士專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師王維平20080401英文縮寫EDTAEEGENEPSPFCMGABAG1UHFSLTDL阻MAPKKNMDNMDAPBSPMSFPKAETHYLENEDIAMINETETRAACETIC乙二胺四乙酸ELECTROENCEPHALOGRAM腦電圖ERRORNUMBER錯誤反應(yīng)次數(shù)EXCITATORYPOSTSYNAPTISPOTENTIALS興奮性突觸后電位FLOWCYTOMETRY流式細(xì)胞術(shù)GAMAAMINOBUTYRICACIDY氨基丁酸GLUTAMICACID谷氨酸HIGHFREQUENCYSTIMULATION高頻刺激LONGTERMDEPRESSION長時程抑制LONGTERMPOTENTIATION長時程增強MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEKINASE有絲分裂原活性蛋白激酶激酶NIMODIPINE尼莫地平NMETHYLDASPARTICN甲基D天門冬氨酸PHOSPHATEBUFFEREDSALINE磷酸鹽緩沖液PHENYLMETHYLSULFONYLFLUORIDE苯甲基磺酰氟PROTEINKINASEA2L

簡介：華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文自我的社會認(rèn)知與自我成長團體姓名呂建國申請學(xué)位級別博士專業(yè)基礎(chǔ)心理學(xué)指導(dǎo)教師俞文釗200051ABSTRACTFROMTHEFUNDAMENTALVIEWPOINTTHATTHESELFGROWSINTHEINTERACTIONBETWEENINDIVIDUALANDCOLLECTIVEACLOSERLOOKISTAKENATTHEJNTERACTIVECONTEXTANDTHESOCIALCOGNITIONOFTHESELFINTHESELFGROWTHGROUPANDACCORDINGTOTHEIDEAOFTHEJNTERNALIZATIONOFTHESOCIALCOGNITIVESTRUCTUREINSELFGROWTHAPROPOSESRAISEDTOMAKESUREOFTHEPOSSIBILITYANDNECESSARYCONDITIONTOADAPTGROUPINTERVENTIONSOFFACILITATINGSELFGROWTHTHROUGHTHESOCIALCOGNITIONSTRUCTUREIMPROVEMENTTHROUGHASETOFFIELDSTUDY，MANAGINGTHESOCIALSELECTINGSITUATIONANDCONFLICTINGFEEDBACKITISFOUNDTHATTHESUBJECTS’WORKINGSEIFCONCEPTMAYCHANGEINTHESITUATIONOFHIGHAROUSALANDHIGHINCONSISTENCYANDTHECHANGEDSELFCONCEPTMAYTAKEPARTINTHEGUIDANCEANDADJUSTMENTOFTHESOCIAICOGNITIONOFTHESELFITISDEMONSTRATETHATINCASETHEINDIVIDUALISTHREATENEDBYTHECONFLICTSITUATIONTHECOLLECTIVESELFMAY10WDOWNINTHECHANGESMENTIONEDABOVESEXDIFFERENCEISANACTIVEMEDIUMFACTORINTHEANALYSISOFTHEDIFFERENTTYPESOFRECEIVINGCONFLICTFEEDBACKITISFOUNDTHATTHEREEISTSTHETENSIONSYSTEMANDTHETENSIONINFLUENCESTHESELFDESCRIPTIONBOMININDIVIDUALSELFANDCOLLECTIVESELGINTHEMUTUAICONSTRUCTIVECOGNITIONFRAMEWORK，CONNECTEDTHESOCIALCOGNITIVETHEORIESOFTHESEL￡AMODELOFMUTUALCONSTRUCTIONINSELFGROWTHISPROPOSEDUNDERTHISMODEL，THE5STEPSOFTHEGROUPPROCESSORIENTATION，OPENNESS，EXPLORATION，RESPONSLBILITYANDINTEGRATION；THE5PRINCIPLESFOROPERATIONPROGRESSIVEORIENTATION，SITUATIONHIGHLIGHT，COGNITIVETENSION，COHORTCOMPOSITIONANDAUTOSELECTION，ARECLEARLYEXPRESSEDINTHECASESTUDYANDINTHETRAININGPROGRAM“THESELFGROWTHILAND”THEPRACTICEOFTHEGROWTHGROUPWASORIGINATEDFROMLEWINIANTGROUPDURING40STHISCENTURYASTHEEARLIESTTYPEOFLEARNINGGROUP，ITWASTHECOMPONENTOFORGANIZATIONDEVELOPMENTLEDBYLEWINANDITHASTHEBASICAIMTOIMPROVEMANAGERSSKILLSOFINTERPERSONALCOMMUNICATION，TOFACILITATEINDIVIDUALGROWTHANDORGANIZATIONALGROWTH，ANDFINALLYTOIMPROVETHEPERFORMANCEOFTHEWHOLEORGANIZATIONTHROUGHTHETHEORETICALANDAPPLICATIVESTUDY，THISRESEARCHOFFERSABENEFICIALFRAMEWORKTOPERSONNELTRAININGIN‘HUMANCENTERED”MANAGEMENTKEYWORDSSOCIALCOGNITIONOFTHESELFSELFGROWTHGROUP，SELFCONCEPT，HUMANCENTEREDMANAGEMENT，GROUPINTERVENTION

簡介：背景現(xiàn)有治療性HPV疫苗在宮頸癌人類臨床試驗中缺乏顯著療效。增強腫瘤抗原特異的殺傷效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答是提升疫苗效果的重要策略。病毒樣顆粒VLPS在激發(fā)體液免疫中己證明具有高度免疫原性，是理想的疫苗載體。目的本研究擬探討以VLPS形式呈遞HPVCTLS抗原肽，考察激發(fā)的特異細(xì)胞免疫應(yīng)答以及對腫瘤生長的干預(yù)，以揭示VLPS作為治療型疫苗載體的應(yīng)用潛能，并提供候選治療性HPV疫苗。方法根據(jù)文獻(xiàn)報道選擇小鼠中證明有效的4個HPV16E6、E7CTLS表位，經(jīng)基因重組將其DNA片段克隆于乙肝核心抗原HBCAG優(yōu)勢抗原表位。重組蛋白在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，以硫酸銨鹽析法和蔗糖密度梯度離心純化，并經(jīng)高效液相凝膠過濾色譜和電鏡進(jìn)行分析鑒定。制備的VLPS以預(yù)防性和治療性策略分別對小鼠TC1細(xì)胞移植腫瘤進(jìn)行免疫干預(yù)。研究檢測了小鼠腫瘤大小變化脾細(xì)胞分離后經(jīng)特異抗原肽刺激，以ELISA檢測IFNΓ表達(dá)，以ELISPOT檢測分泌IFNΓ的淋巴細(xì)胞，并以流式細(xì)胞分析儀檢測CD8IFNΓ細(xì)胞此外，本研究還評價了VLPS疫苗刺激機體產(chǎn)生的免疫記憶，探討了體內(nèi)預(yù)存的抗載體抗體、VLPS結(jié)構(gòu)、免疫途徑等因素對抗原特異治療性VLPS疫苗免疫的影響。結(jié)果重組蛋白在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，純化的蛋白主要以VLPS形式存在基于E74957表位的VLPS以預(yù)防性策略免疫小鼠后，完全抑制了移植腫瘤的生長在治療性策略中，VLPS顯著抑制了23MM腫瘤的增長，對于56MM甚至更大的腫瘤（89MM），VLPS疫苗免疫同樣顯示了明顯的腫瘤生長抑制作用此外，VLPS疫苗刺激機體產(chǎn)生了有效的免疫記憶應(yīng)答，最少可持續(xù)15周機體預(yù)存的抗載體抗體對VLPS疫苗發(fā)揮作用無顯著影響抗原肽體外刺激脾細(xì)胞，結(jié)果顯示疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞具有增強的IFNΓ表達(dá)，提高的分泌IFNΓ的淋巴細(xì)胞水平，以及增加的小鼠體內(nèi)CD8IFNΓ細(xì)胞數(shù)目。結(jié)論呈遞HPVE7CTLS表位的VLPS疫苗能夠激發(fā)持續(xù)有效的E7特異細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著抑制腫瘤生長，有希望作為候選治療性HPV疫苗，同時，HBCAGVLPS是有應(yīng)用潛能的治療性疫苗載體。

簡介：自從1954年首次成功在孿生子問進(jìn)行腎移植以來，經(jīng)過半個世紀(jì)的不懈努力，腎移植技術(shù)已從探索走向成熟。近年來，由于技術(shù)的改進(jìn)，對免疫學(xué)認(rèn)識的深入以及強有力免疫抑制劑的問世，患者的近中期生存率及生活質(zhì)量已有極大的改善，1年尸腎存活率已達(dá)96％，5年腎存活率達(dá)80％。但是器官移植后受者的人類巨細(xì)胞病毒HUMANCYTOMEGALOVIRUSHCMV感染仍然是導(dǎo)致移植后患者死亡的主要原因之一。移植術(shù)后CMV肺部感染發(fā)生率為20％～70％，且15％～35％為有癥狀的CMV病，典型的CMV肺部感染多發(fā)生于移植術(shù)后1～6個月內(nèi)。CMV在全世界成人中感染率為60％～100％，多為潛伏性感染，機體表現(xiàn)為持續(xù)血清學(xué)陽性即抗CMV抗體IGG陽性。當(dāng)免疫功能下降、特別是細(xì)胞免疫力低下時，機體又可新感染CMV，或潛伏的病毒再次激活、復(fù)制，形成活動性CMV感染，重者則發(fā)生明顯的“CMV病”，在這種情況下，CMV常與其他病原體使免疫功能低下者發(fā)生二重或多重感染，病情兇險，死亡率高。CMV肺部感染被認(rèn)為不僅是器官移植術(shù)后近期死亡的重要原因，而且還可能與急性排斥反應(yīng)和慢性移植物失功有關(guān)。如能早期診斷活動性CMV感染，并及時給予抗病毒治療可有效改善免疫受抑制和免疫缺陷病人活動性HCMV感染的癥狀，降低其疾病的嚴(yán)重性和死亡率。因此，在監(jiān)測CMV易感病人時，應(yīng)及早而準(zhǔn)確地把握病人是否發(fā)生活動性HCMV感染，這樣才能及時治療活動性感染的病人，又使未發(fā)生活動性感染的病人免受抗病毒藥的毒性損害。第一部分建立NASBBA法檢測即刻早期核糖核酸的實驗條件及在器官移植后巨細(xì)胞病毒感染診斷中的初步實驗研究目的器官移植術(shù)后CMV感染是導(dǎo)致移植后患者死亡的主要原因之一，因而早期、快速而準(zhǔn)確地診斷CMV活動性感染已成為監(jiān)測CMV感染狀況、及時給予抗病毒治療以及判斷預(yù)后的關(guān)鍵。關(guān)于CMV的診斷方法很多，如病毒包涵體檢查、病毒分離培養(yǎng)、血清抗體檢測及DNA聚合酶反應(yīng)PCR、CMV抗原血癥的檢測等，這些方法各有優(yōu)缺點，但是存在一個共同的不足之處，即無法區(qū)分CMV潛伏性感染和活動性感染。隨著對CMV基因組的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)即刻早期和晚期基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和病毒復(fù)制緊密相連，由此提出檢測病毒MRNA是快速診斷CMV活動性感染的一項黃金指標(biāo)。近年來，應(yīng)用核酸基礎(chǔ)序列擴增NUCLEICACIDSEQUENCEBASEDAMPLIFICATION，NASBA技術(shù)檢測病毒RNA得到了快速發(fā)展。NASBA法檢測RNA是一項引物依賴性的核酸技術(shù)，我院自2000年1月始采用該法測定PP67MRNA用于移植術(shù)后CMV活動性感染的臨床診斷，取得了許多經(jīng)驗，PP67MRNA檢測雖然特異性高，但敏感度低，而且陽性結(jié)果出現(xiàn)時間較晚等缺點，不能滿足臨床的需要。為了尋求更好的檢測指標(biāo)，于2004年1月，我們建立了應(yīng)用NASBA法檢測即刻早期核糖核酸IMMEDIATEEARLYMRNA，IEMRNA的實驗條件，結(jié)合臨床實際，并與PP67和抗原血癥檢測相比較。方法病例為我院2004年1月～2004年6月接受器官移植的患者，共42例，腎移植25例，肝移植13例，骨髓移植4例。術(shù)后每周抽抗凝血一次至術(shù)后3個月。首先建立NASBA法檢測LEMRNA的實驗條件及相關(guān)試劑的合成。采用NASBA法檢測IEMRNA、PP67MRNA，同時進(jìn)行免疫組化ENVISIONTM二步法檢測PP65抗原血癥。所有患者均采用PREDMMFCSAFK506三聯(lián)免疫抑制治療。術(shù)后采用普遍性預(yù)防抗病毒治療方案，給予丙氧鳥苷25～5MGKG1D1，分2次靜脈滴注，共2周。如患者發(fā)生CMV病則丙氧鳥苷劑量加倍。20例健康成人的血標(biāo)本作為陰性對照。結(jié)果42例器官移植術(shù)后患者共收集了134份外周血標(biāo)本，分別進(jìn)行了PP65抗原、PP67MRNA及IEMRNA的檢測，有2份標(biāo)本擴增野生型MRNA及SCMRNA失敗，視為無效，有效標(biāo)本數(shù)實為132份。36份抗原血癥陽性≥1個5萬PMNL標(biāo)本中有25份IEMRNA同時陽性，陽性符合率為694％；13份PP67MRNA陽性標(biāo)本中有11份IEMRNA陽性，陽性符合率為846％。42例移植術(shù)后患者中，檢出PP65抗原陽性≥1個5萬PMNL25例陽性檢出率595％，PP67MRNA陽性11例陽性檢出率262％，IEMRNA陽性16例陽性檢出率381％。發(fā)生有癥狀的活動性CMV感染CMV病11例，其中抗原陽性8例，PP67MRNA陽性6例，IEMRNA陽性10例。IEMRNA的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為909％、806％、625％和961％。結(jié)論1NASBA法檢測CMVMRNA具有便捷、快速、準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點，特異性高，假陽性率低。2PP67MRNA的檢出對疾病診斷具有高的特異性，但敏感度低，不適于作為移植后先發(fā)制人抗病毒治療方案的依據(jù)，可以作為一個判斷預(yù)后的指標(biāo)。3IEMRNA的檢測具有較理想的敏感性和特異度，IEMRNA能夠更好的反映CMV活動性感染的狀況，是病毒活動性感染的早期診斷指標(biāo)。第二部分NASBA法檢測即刻早期核糖核酸在腎移植后巨細(xì)胞病毒感染診斷和指導(dǎo)治療中的意義研究目的目前腎移植后抗CMV病的重點是預(yù)防，包括普遍性預(yù)防抗病毒治療和先發(fā)制人PREEMPTIVETHERAPY治療。普遍性預(yù)防治療會給患者帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和加重的藥物毒性問題，先發(fā)制人的抗病毒治療方案，可以減少治療的費用與藥物毒性而又不會延誤治療，早期檢測到活動性CMV感染是先發(fā)制人方案的先決條件。為了準(zhǔn)確地把握好臨床的用藥時機，準(zhǔn)確地開始和終止用藥，減少不必要的經(jīng)濟損失和藥物毒負(fù)作用等，這就要求實驗室的檢測能夠早期、快速、準(zhǔn)確可靠反映HCMV的活動狀況，同時能夠動態(tài)地檢測CMV在受者體內(nèi)的活動變化。在此前提下，我們對腎移植術(shù)后55例患者的CMVLEMRNA、PP67MRNA、PP65抗原以及血清學(xué)抗體進(jìn)行了動態(tài)檢測，結(jié)合抗病毒治療，尋找一種可用于先發(fā)制人抗病毒治療方案的最佳指標(biāo)。方法病例選自我院接受腎移植的患者，共55例，術(shù)前所有供者和受者均采取不抗凝血標(biāo)本，用ELISA檢測CMVIGG和IGM抗體。術(shù)后每周抽EDTA抗凝血一次共3個月，分別采用NASBA法檢測IEMRNA、PP67MRNA和免疫組化ENVISIONTM二步法檢測PP65抗原血癥。均采用PREDMMFCSAFK506三聯(lián)免疫抑制治療，發(fā)生急性排斥反應(yīng)者給予MP沖擊治療3～5天，無效者改用ATG或OKT3。初次檢出任何一項陽性結(jié)果時靜脈給予丙氧鳥苷25～5MGKG1D1，直至轉(zhuǎn)陰后繼續(xù)治療7～14天。發(fā)現(xiàn)CMV病時丙氧鳥苷劑量加倍，治療無效或出現(xiàn)毒副作用如白細(xì)胞、血小板低下時改用磷甲酸鈉。結(jié)果1術(shù)前血清學(xué)狀況及術(shù)后CMV病感染率術(shù)前供者LGG抗體陽性者15例，接受陽性供體的受者7例為IGG陽性，8例為IGG陰性。接受供者IGG抗體陽性腎臟患者的感染率明顯高于陰性者。2CMV抗原指數(shù)檢測結(jié)果55例患者術(shù)后出現(xiàn)抗原陽性29例527％，陽性細(xì)胞數(shù)為20～6055萬PMNL，平均1235萬PMNL，其中＞10個5萬PMNL者17例，＞20個5萬PMNL者5例。觀察期內(nèi)術(shù)后半年內(nèi)發(fā)生有癥狀的活動性CMV感染CMV病13例。發(fā)生CMV病者的平均抗原指數(shù)高于非CMV病患者。IEMRNA陽性患者的平均抗原指數(shù)高于陰性者。3IEMRNA、PP67MRNA及抗原血癥診斷指標(biāo)比較55例患者中，PP65抗原血癥陽性29例527％，PP67MRNA陽性14例254％，IEMRNA陽性20例364％。發(fā)生有CMV病13例，均接受了更昔洛韋治療，10例治療后檢測結(jié)果陰轉(zhuǎn)，同時癥狀消失。有2例出現(xiàn)ARDS，其中1例因呼吸衰竭死亡。IEMRNA的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為923％、809％、600％和971％。4三項檢測指標(biāo)的動態(tài)變化LEMRNA首次檢出平均時間31O±154天，早于PP67MRNA437±163和PP65抗原血癥396±156天。而PP67MRNA的平均陰轉(zhuǎn)時間早于其他兩項。結(jié)論1腎移植術(shù)前病人的CMV血清學(xué)狀況無論是陽性還是陰性，如果接受CMV陽性供者的腎臟，則術(shù)后感染發(fā)生率明顯高于接受CMV陰性供者腎臟的病人。2CMV病患者的平均抗原指數(shù)水平高于非CMV病者，說明抗原指數(shù)與CMV感染的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系。但某些抗原指數(shù)高者可能并無臨床癥狀，而低抗原指數(shù)者也有可能出現(xiàn)明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)。IEMRNA陽性者的平均抗原指數(shù)高于陰性者。3IEMRNA具有相對合適的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，IEMRNA的檢測能夠更好的反映CMV活動性感染的狀況。而PP67具有較高的特異性，陽性結(jié)果代表了CMV病已經(jīng)到了嚴(yán)重程度，對判斷預(yù)后有一定的意義。4IEMRNA首次檢出的平均時間早于PP67MRNA和PP65抗原血癥。而PP67MRNA的平均陰轉(zhuǎn)時間早于其他兩項。LEMRNA檢出時間早有利于掌握最佳用藥時機，防止了病情的延誤，使患者得到及時的治療。

簡介：目的觀察咳喘寧防治病毒誘發(fā)小兒哮喘的臨床療效，并通過觀察咳喘寧對患兒病毒感染階段TH亞群細(xì)胞因子表達(dá)的影響，闡明其免疫調(diào)節(jié)作用機理，為哮喘病的防治提供理論與實踐依據(jù)。方法采用隨機、單盲、對照的方法，將120例病毒誘發(fā)哮喘患兒隨機分為咳喘寧治療組60例和西藥對照組60例，觀察7天后臨床癥狀積分的改變。采用酶聯(lián)免疫雙抗體夾心ELISA法檢測患兒血清中TH1型細(xì)胞因子IL12與TH2型細(xì)胞因子IL4的含量，并分析其治療前后的變化。結(jié)果1咳喘寧治療組無論是總有效率還是臨床控制率，均明顯優(yōu)于對照組，其在改善噴嚏、流涕、咳嗽、咯痰等方面效果更明顯。2咳喘寧的療效與患兒性別、病程無關(guān)，但與患兒年齡有關(guān)，年齡越小，療效越好。3病毒誘發(fā)哮喘患兒血清TH1型細(xì)胞因子IL12水平降低，TH2型細(xì)胞因子IL4及外周血嗜酸性粒細(xì)胞EOS水平升高，IL12與IL4水平成負(fù)相關(guān)，IL4與EOS水平呈正相關(guān)，IL12與EOS水平呈負(fù)相關(guān)。說明患兒TH1TH2型細(xì)胞因子水平處于失衡狀態(tài)。咳喘寧能顯著提高患兒血中IL12，降低IL4，從而對病毒誘發(fā)哮喘患兒TH亞群產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，其作用明顯優(yōu)于對照組?？却瓕幠苊黠@降低患兒外周血EOS水平，其作用比對照組更明顯。結(jié)論咳喘寧防治病毒誘發(fā)小兒哮喘具有較好療效，其作用機制與提高患兒IL12水平，降低IL4與EOS水平有關(guān)。

簡介：目的1、應(yīng)用HBV復(fù)制小鼠模型研究MIFNΑ不同亞型對HBV的抗病毒效果。2、探索MIFNΑ不同亞型的抗HBV作用機制。3、為揭示臨床IFNΑ治療HBV慢性感染患者應(yīng)答不佳的分子機制及探索新的HBV治療策略提供實驗依據(jù)。方法1、尾靜脈高壓水注射PAAVHBV12質(zhì)粒于BALBC建立HBV復(fù)制小鼠模型在注射質(zhì)粒的前1天至注射后第8天每天腹腔注射MIFNΑ1、Α2、Α4、Α5、Α6、Α9、Α11重組蛋白僅注射生理鹽水組小鼠作為對照。2、注射質(zhì)粒后1、4、7、10天內(nèi)眥靜脈取血ELISA檢測血清HBSAG、HBEAG、HBSAB、HBEAB和HBCAB定量PCR檢測HBVDNA水平第4天和10天每組處死35只小鼠取肝組織免疫組化檢測肝內(nèi)HBCAG表達(dá)水平定量PCR檢測肝內(nèi)HBVDNA水平以及干擾素刺激基因OAS和PKR的MRNA水平。3、GRAPHPADPRISM5軟件作圖SPSS170對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析統(tǒng)計學(xué)方法為方差分析P結(jié)果1、在HBV復(fù)制小鼠模型中MIFNΑ5對血清HBSAG、HBEAG和HBVDNA的抑制效果最明顯MIFNΑ11的抑制效果最弱2、MIFNΑ處理組小鼠血清中HBSAB、HBEAB和HBCAB的表達(dá)均無明顯變化3、在HBV復(fù)制小鼠模型中MIFNΑ5對肝組織內(nèi)HBCAG的表達(dá)以及HBVDNA的復(fù)制抑制效果最明顯MIFNΑ11的抑制效果最弱4、MIFNΑ4、Α5處理組OASMRNA水平與HBVDNA水平成負(fù)相關(guān)其它處理組無明顯相關(guān)性。結(jié)論1、在HBV復(fù)制小鼠模型中MIFNΑ5對HBV復(fù)制的抑制效果最明顯MIFNΑ11的抑制效果最弱。2、不同亞型MIFNΑ抗HBV作用差異的機制有待進(jìn)一步深入研究。本研究的創(chuàng)新點及意義本研究表明在HBV復(fù)制小鼠模型中不同MIFNΑ亞型的抗病毒效果存在差異MIFNΑ5抗HBV效果比目前臨床常用的IFNΑ2更明顯本研究為臨床研發(fā)抗HBV感染的新型高效IFNΑ提供了實驗依據(jù)。

簡介：漢坦病毒（HANTAVIRUS）屬于布尼亞病毒科，是一種有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。漢坦病毒主要引起兩種急性傳染病，一種是腎綜合征出血熱（HEMRHAGICFEVERWITHRENALSYNDROME，HFRS），該病是我國重點防治的傳染病；另一種是漢坦病毒肺綜合征（HANTAVIRUSPULMONARYSYNDROME，HPS），主要流行于美洲國家。HFRS是以發(fā)熱、出血和腎功能損害為主要特征的一種急性病毒性傳染病。病毒感染人體后可以侵犯內(nèi)皮細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞，誘生各類細(xì)胞因子的變化，最終導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂、血管通透性增加等一系列病理改變。但其具體機制尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。病毒的感染并非是泛嗜性的，每一種病毒通常只能感染某種或某些特定的靶細(xì)胞。通常，病毒由靶細(xì)胞表面的特異分子介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，該分子可作為病毒受體參與病毒的識別與結(jié)合等過程。病毒與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合是病毒感染致病的第一步。Β3整合素已確認(rèn)為致病性漢坦病毒的受體，Β3整合素上的PSI結(jié)構(gòu)域（PLEXINSEMAPHIN–INTEGRIN，PSI）是漢坦病毒與整合素相互作用的位點。然而，近年來有研究報道，網(wǎng)格蛋白（CLATHRIN）相關(guān)的受體可能介導(dǎo)了漢坦病毒的吸附和入胞過程，但由于抑制網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用并同時抑制Β3整合素并不能完全阻斷漢坦病毒的內(nèi)化，因此漢坦病毒很可能還存在其他的內(nèi)化通路。另外，本實驗室前期在應(yīng)用RAS募集（RASRECRUITMENTSYSTEM，RRS）酵母雙雜交系統(tǒng)研究漢坦病毒包膜糖蛋白相互作用分子，尋找病毒受體的研究中發(fā)現(xiàn)，漢坦病毒包膜糖蛋白G1、G2均可以與纖維連接蛋白（FIBRONECTIN，F(xiàn)N）相互作用。FN是由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和肝臟產(chǎn)生的一種多功能蛋白質(zhì)它的合成和降解由轉(zhuǎn)化生長因子Β（TGFΒ）調(diào)節(jié)。研究表明，F(xiàn)N在多種病毒感染過程中起重要作用，與病毒的入胞過程和致病過程密切相關(guān)。那么，漢坦病毒是否還存在著其他入胞途徑FN在漢坦病毒感染過程中又有什么作用呢是否能輔助病毒入胞，以及是否在漢坦病毒感染致病中起重要作用基于以上疑問，圍繞FN進(jìn)行了如下研究1、FN與漢坦病毒核衣殼蛋白及小窩蛋白的共定位研究已知網(wǎng)格蛋白依賴型入胞途徑和小窩蛋白依賴型內(nèi)吞途徑是許多病毒入胞的重要途徑。為了確定漢坦病毒是否可以由FN介導(dǎo)經(jīng)小窩途徑入胞，我們研究了漢坦病毒與FN及小窩蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位關(guān)系。首先基于空斑形成實驗的實驗結(jié)果，應(yīng)用微量細(xì)胞培養(yǎng)法（雙抗夾心ELISA）測定漢坦病毒的TCID50，對病毒感染滴度進(jìn)行了滴定。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用共聚焦顯微鏡分別觀察了漢坦病毒感染的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中漢坦病毒與FN和小窩蛋白在感染細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞水平的共定位關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)漢坦病毒NP與FN和小窩蛋白可以共定位于HUVEC的細(xì)胞膜和細(xì)胞核周區(qū)域從而說明了漢坦病毒的入胞途徑除了可以通過網(wǎng)格蛋白依賴的入胞途徑外，可能還可通過FN介導(dǎo)的小窩蛋白途徑進(jìn)入細(xì)胞。2、不同F(xiàn)N片段對漢坦病毒感染的競爭抑制試驗為進(jìn)一步明確FN分子在漢坦病毒感染中的作用，我們應(yīng)用5種FN片段進(jìn)行了漢坦病毒感染競爭抑制試驗，以確定FN分子中的哪個結(jié)構(gòu)片段或者哪種形式在漢坦病毒感染過程中起作用。具體方法是采用重組全長FN、細(xì)胞結(jié)合片段、連接區(qū)片段、鉸鏈區(qū)片段、硫酸肝素結(jié)合片段競爭抑制漢坦病毒感染敏感細(xì)胞HUVEC。用ELISA試驗分別檢測病毒抗原，結(jié)果表明，5種FN片段無論加入的濃度高低，對漢坦病毒的感染均有一定的抑制作用。特別是40KDA的連接區(qū)片段對漢坦病毒感染的抑制作用具有濃度依賴性，即隨著其濃度的增加病毒的載量也漸次減低。其余4種片段對漢坦病毒感染的阻抑作用并未隨著加入片段的濃度升高而增強，因此其阻抑病毒感染的作用可能具有非特異性。3、腎綜合征出血熱患者不同病期外周血FN及TGFΒ1的動態(tài)變化為探求FN及其相關(guān)因子TGFΒ1在漢坦病毒致病中的作用，共采集了HFRS患者不同病期的血清、血漿樣本各260份，以及正常人血樣30份。首先應(yīng)用WESTERNBLOT檢測到HFRS患者血清中含有FN；繼而應(yīng)用ELISA法對HFRS患者及健康人血清、血漿中FN及其相關(guān)細(xì)胞因子TGFΒ1進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFRS患者不同病期血漿中FN水平隨病期的推移呈波動升高趨勢，其中發(fā)熱期、低血壓休克期、少尿期患者血漿中FN水平均低于正常對照組。多尿期、恢復(fù)期血漿中FN水平均高于正常對照組（P綜上所述，在漢坦病毒感染過程中，F(xiàn)N有可能起到多種作用。在漢坦病毒感染時，病毒可能通過由組織型FN介導(dǎo)的小窩途徑入胞，且其FN連接區(qū)部位可能起到關(guān)鍵作用。同時，TGFΒ1與HFRS患者體內(nèi)FN的關(guān)系還有待進(jìn)一步的探討。本研究結(jié)果為進(jìn)一步從分子水平上闡明漢坦病毒的入胞和致病機制提供了新的線索和依據(jù)。

簡介：分類號R3密級單位代碼學(xué)號1031220121004南京醫(yī)斜犬掌碩士學(xué)位論文題學(xué)科專業(yè)生理堂學(xué)院名稱直京醫(yī)型太堂基趟醫(yī)堂院目錄中文摘要LABSTRACT6第一部分SEIPIN缺失對情緒行為的影響及其性別差異13前言1。3一日Ⅱ舌材料和方法15結(jié)果22討論30參考文獻(xiàn)34第二部分SEIPIN缺失對認(rèn)知行為的影響及其分子機制研究38前言38月O舌J芍材料和方法39結(jié)果46討念54參考文獻(xiàn)一58綜述一62英文縮寫及中英文全名對照表74攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況75致謝78

簡介：目的；構(gòu)建漢坦病毒HANTAVIRUS，HV莒南擴增株JUN05株核衣殼蛋白NUCLEOCAPSIDPROTEIN，NP的熒光蛋白表達(dá)載體；將HVNP基因與EGFP基因在BHK21細(xì)胞中融合表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)強度，以及融合蛋白在細(xì)胞中定位和分布，免疫組化觀察融合蛋白的免疫反應(yīng)性，從而為新型HV診斷試劑研制與開發(fā)，以及NP結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定基礎(chǔ)。方法；根據(jù)HV莒南擴增株JUN05株NP基因的序列和表達(dá)載體PEGFPN1的多克隆位點序列，設(shè)計引物，通過PCR的方法擴增NP全基因。PCR產(chǎn)物回收后以核酸內(nèi)切酶BGLⅡ、PSTⅠ雙酶切，克隆至同樣雙酶切的PEGFPN1載體上，并保持NP基因與EGFP基因的讀碼框一致，CACL2法轉(zhuǎn)化并篩選陽性克隆。通過PCR方法和雙酶切方法鑒定，并通過DNA測序技術(shù)最終鑒定表達(dá)載體的構(gòu)建情況。將重組質(zhì)粒以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24H后固定細(xì)胞，熒光顯微鏡檢和免疫組化技術(shù)觀察融合蛋白的表達(dá)并拍照記錄。結(jié)果；1構(gòu)建了含有HVNP基因的熒光蛋白表達(dá)載體，酶切鑒定、PCR鑒定、及測序結(jié)果表明載體構(gòu)建成功。2測序結(jié)果表明，NP基因成功連入EGFP基因上游，二者讀碼框一致無移位，與NP基因在克隆載體中的序列比對，無PCR擴增導(dǎo)致的堿基突變，并且NP基因末端的終止密碼子TAA被去除。并添加了KOZAK序列，為高效表達(dá)提供了基因水平的改造。3熒光顯微鏡下觀察，NPEGFP融合蛋白在BHK21細(xì)胞中得到高效表達(dá)，細(xì)胞漿內(nèi)充滿了致密的綠色熒光，熒光呈核周分布，達(dá)到了以綠色熒光蛋白作為報告基因觀察NP的表達(dá)及定位的目的。免疫組化也出現(xiàn)了陽性信號。結(jié)論；本次研究利用基因工程技術(shù)成功地構(gòu)建了含有HV莒南擴增株JUN05株NP全長基因的表達(dá)載體PEGFPNP。NP基因成功連入EGFP基因上游，使NP基因位于CMV啟動子之下，并添加了KOZAK序列，為高效表達(dá)提供了基因水平的改造。融合蛋白NPEGFP基因在BHK21細(xì)胞中得到了高效表達(dá)，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，表達(dá)的融合蛋白具有NP和EGFP的雙重活性，可用綠色熒光蛋白作為報告基因觀察NP的表達(dá)及定位，并為進(jìn)一步篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，大量制備純化該蛋白，應(yīng)用于HV的診斷奠定了基礎(chǔ)。

簡介：中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文逆轉(zhuǎn)錄病毒中介TNFΑ基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的TIL抗人腦膠質(zhì)瘤效應(yīng)的實驗研究姓名關(guān)俊宏申請學(xué)位級別博士專業(yè)外科學(xué)指導(dǎo)教師陳淑珍200341X109，平均擴增274445倍，表明人腦膠質(zhì)瘤TIL體外在IL一2作用下可得到良好的增殖；人腦膠質(zhì)瘤TIL對TJ8510細(xì)胞殺傷活性與其培養(yǎng)時間相關(guān)，7FIL經(jīng)IL一2培養(yǎng)10天，呈現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，但殺傷活性較低，而此時LAK的殺傷活性明顯高于TIL；當(dāng)培養(yǎng)20天時TIL殺傷活性迅速增加，而LAK殺傷活性迅速下降，兩者差異顯著；30天時TIL殺傷活性處于高峰，而LAK殺傷活性繼續(xù)下降。提示人腦膠質(zhì)瘤TIL對IL一2反應(yīng)遲鈍，活化潛伏期長，而LAK細(xì)胞則相反，TIL體外抗瘤活性與增殖能力相關(guān)。2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)前后，細(xì)胞的增殖情況未受到明顯影響，證明逆轉(zhuǎn)錄病毒中介的基因轉(zhuǎn)移并不影響宿主細(xì)胞自身的功能，TIL完全符合基因治療中運載細(xì)胞的要求；對TNFA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后的TIL細(xì)胞TNFA表達(dá)水平的檢測結(jié)果顯示TNFTIL細(xì)胞TNFD的分泌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過TIL細(xì)胞和NEOR一‘FIL細(xì)胞；TNFTIL細(xì)胞表達(dá)TNFD的動態(tài)觀察結(jié)果TNFTIL細(xì)胞在體外培養(yǎng)30天，可持續(xù)表達(dá)高水平的TNFOL，說明導(dǎo)入TNF一0【基因已完整、穩(wěn)定地整合于TIL細(xì)胞基因組中并獲得了表達(dá)。比較TIL、NEOR一7FIL和TNFTIL三者的抗瘤活性，本實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)導(dǎo)TNFA基因的‘FIL細(xì)胞對人腦膠質(zhì)瘤TJ8510細(xì)胞的體外抗瘤活性明顯提高，與TIL和NEORTIL相比差異顯著，我們認(rèn)為這是由于TNFD基因轉(zhuǎn)導(dǎo)TIL細(xì)胞后，能持續(xù)高水平地分泌內(nèi)源性的TNFD，從而放大了TIL自身的抗瘤活性。3局部轉(zhuǎn)輸TNFTIL和靜脈轉(zhuǎn)輸TNF一耵L均能明顯抑制裸鼠皮下腫瘤的生長，且抑瘤效果高于TIL治療組，TIL靜脈轉(zhuǎn)輸元明顯抑瘤效果，說明TNF一僅基因轉(zhuǎn)染TIL放大了TIL的體內(nèi)抗瘤效應(yīng)；而局部轉(zhuǎn)輸TNF一‘RIL較靜脈轉(zhuǎn)輸TNFTIL對腫瘤生長的抑制效果更為明顯，提示過繼性免疫治療膠質(zhì)瘤以局部轉(zhuǎn)輸方式為佳。雖然靜脈轉(zhuǎn)輸TNFTIL的治療效果不及局部轉(zhuǎn)輸，但也能抑制人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下實體瘤的生長，與單純靜脈轉(zhuǎn)輸TIL的抑瘤效果差異顯著。我們認(rèn)為其原因可能是①TNFD基因轉(zhuǎn)染后，放大了腫瘤局部TIL的抗瘤效應(yīng)；②血循環(huán)中的TNFTIL分泌的TNF一0【可能在一定程度上發(fā)揮了全身抗腫瘤作用。2

簡介：I分類號分類號密級密級UDC學(xué)號學(xué)號406211212029南昌大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)慢病毒介導(dǎo)BMPRII基因基因沉默對人肝癌移植瘤生長沉默對人肝癌移植瘤生長的影響的影響THEEFFECTOFBMPRIIGENESILENCINGONTHEGROWTHOFHUMANHEPATOCELLULARCARCINOMATRANSPLANTATIONTUM王碩培養(yǎng)單位（院、系）南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院指導(dǎo)教師姓名、職稱吳建兵教授主任醫(yī)師申請學(xué)位的學(xué)科門類醫(yī)學(xué)學(xué)科專業(yè)名稱腫瘤學(xué)論文答辯日期2015年5月答辯委員會主席徐方云評閱人陳麗周存才2015年5月摘要II摘要目的目的探討B(tài)MPRII基因RNA干擾（RNAI）的重組慢病毒載體對人肝癌HEPG2細(xì)胞裸鼠移植瘤BMPRII基因表達(dá)和移植瘤生長的影響。方法方法1、前期研究已明確了具有下調(diào)BMPRII基因的SIRNA干擾序列，設(shè)計并合成SHRNAOLIGO退火后構(gòu)建入干擾慢病毒載體PLSHRNAFBMPRII，用構(gòu)建的慢病毒載體PLSHRNAFBMPRII轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝慢病毒，并用熒光法測定滴度，用包裝的PLSHRNAFBMPRII干擾慢病毒侵染HEPG2細(xì)胞。2、通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)QRTPCR、蛋白印跡（WESTERNBLOT）技術(shù)檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中BMPRIIMRNA及蛋白水平表達(dá)的變化，明確處理后BMPRII沉默的效果。3、建立人肝癌HEPG2細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，隨機分成實驗組、陰性對照組和空白對照組。隔天1次向各組動物腫瘤內(nèi)分別注射BMPRIISHRNA慢病毒顆粒、攜帶無效序列的慢病毒顆粒和09氯化鈉溶液02ML，共5次，測量各組腫瘤體積的大小，繪制腫瘤生長曲線，13天后處死裸鼠。4、應(yīng)用WESTERNBLOT及免疫組化技術(shù)檢測移植瘤中BMPRII蛋白水平表達(dá)。結(jié)果結(jié)果1、QRTPCR及WESTERNBOLT檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組與空白對照組及陰性對照組相比，BMPRIIMRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P005）?？瞻讓φ战M和陰性對照組剝脫的瘤體體積分別為（1274613302）MM3和（1255213005）MM3，而實驗組剝脫的瘤體體積為（32868772）MM3