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簡介：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文質(zhì)粒輔助2型重組腺相關(guān)病毒的制備及其針對腦缺血和膠質(zhì)細胞瘤基因治療的改建姓名李桂林申請學(xué)位級別博士專業(yè)外科學(xué)（神經(jīng)外科）指導(dǎo)教師王任直20030501串囂蟄弱鞋辯大學(xué)贛瘴鐾耩圭學(xué)袋論文中文摘要夔著人類基鑫緩詩翔愆寵或窩幼縫基因醑究黲并震，霹瓣予基因滲療豹凌能基因越來越多。基因治療越來越可能成為鏟除人旋難治性疾瘸的利劍?；蛑委熓滓年P(guān)鍵技術(shù)是如何將目的基因輸送并進入到特定的靶細胞，使之高效的表這鄉(xiāng)}源基瓣，困瑟對基濯治療載諺戇選擇一壹是瓣魏基因浚療深入疆究夔娥駐。自七十年代末提出病毒載體的概念以來，應(yīng)用于基因治療研究的缺陷性病毒裁體種類越來越多，應(yīng)用也越來越廣泛。緞是，單純癔疹病毒載體的神經(jīng)毒性，腺病毒載霹熬篼痰疆洼纛逆轉(zhuǎn)錄瘋毒夔撬整合夔致瘞魏臻隈裁了窀鈉在孛褪亭孛綴系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。RAAV載體以其安全性好、宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高等幾方面的突出優(yōu)勢而倍受關(guān)注，是目前中樞車申經(jīng)系統(tǒng)基因治療的良好被體。毽楚，RAAV翻簧溺燕，是驀蘩黻褥鞋RAAV為載藩逶雩亍蒸囂治療磺炎漿難題之一。現(xiàn)在所采用的RAAV的制備方法操作復(fù)雜，對設(shè)備要求離，在普通寅驗室難以完成。如何優(yōu)化～種簡便易行，對實驗條件要求不高，可滿足動物實驗的需要，在蟄遁實驗室藏溪豁完殘豹RAAV靜重綴幫縫純方案瑟RAAV熒載缽懿基因治療的研究有重要的推動作用。此外，通用型的RAAV并不能很好的滿足缺呶性腦血管瘸和腦膠質(zhì)細胞瘤基囂治療瓣需要。逶矮麓CMV襄動予豹藤穩(wěn)美瘸爨載傣長鬃袋遮委瓣薹蠢，黯腦缺血進行基因治療時裊導(dǎo)致血管過度增生和促進潛在腫瘤生長，在基因治療的安全性方灝存在一定的缺陷，如果改避病毒載體感動子，使目的蒸因僅在腦缺衄露表述，魏蠆鞋在安全羧方覆取褥受翔照好靜效萊。露在藏藪震緇麓瘞治療方覆神經(jīng)元對RAAV的親和能力比膠質(zhì)細胞強，因此對于毒性基因治療膠質(zhì)細胞腫瘤必須采用膠贗細胞特異設(shè)表達的RAAV，來實現(xiàn)毒蝕基因的選攆性表達?；璐辽显迹阏欘}對囊粒輔萌2壅重綴豫穩(wěn)關(guān)病毒熬裁備及英鎊辯弦缺血和膠質(zhì)細胞瘤基因治療的改建進杼了研究。質(zhì)粒輔助2型重組腺相關(guān)病毒制各方法的優(yōu)化本研究聚用質(zhì)粒輔助腺相關(guān)病毒重綴系統(tǒng)，逶過磷酸鈣質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染麓方法，農(nóng)HEK293T綴艟內(nèi)臺殘RAAV，通過氯仿一PEG8000／N孵L一氯仿法接合超濾純化RAAV病毒。通過蛋白電泳和WESTERN雜交檢測病毒外鞘蛋白，斑點雜交和病毒轉(zhuǎn)染檢測瘸瀨的物理和生物潦度證實倪他后豹該方法W數(shù)獲得高滴度的RAAV，霹演是小動物實驗靛羆蘩，對3

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簡介：分類號R749055密級學(xué)位類別科學(xué)學(xué)位團專業(yè)學(xué)位口◇學(xué)校代碼10062學(xué)號2010602562學(xué)科門類醫(yī)學(xué)又洱眚科鼻辱碩士學(xué)位論文MASTER’SDISSERTATION論文題目貧困大學(xué)生自卑感內(nèi)觀認知療法干預(yù)研究TITLETHEINTERVENTIONSTUDYOFNAIKANCOGNITIVETHERPYON。IPOVERISHEDCOLLEGWITHIHERAPY0NIMPOVERISHEDCOLLE2ESTUDENTSWITHFEELINGOFINFERIORITY一級學(xué)科臨床醫(yī)學(xué)二級學(xué)科精神病與精神衛(wèi)生學(xué)論文作者柳雷指導(dǎo)教師毛富強教授天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二O一三年五月天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要目的由于多種原因，在校貧困大學(xué)生逐年增多，而社會的急劇轉(zhuǎn)型、社會文化的變遷以及環(huán)境的迅速變化，尤其是經(jīng)濟上的原因，給貧困大學(xué)生帶來了一系列的沖擊和壓力，使貧困大學(xué)生的心理問題較非貧困大學(xué)生顯著增多，而貧困大學(xué)生的主要心理問題是自卑，所以改善貧困大學(xué)生的自卑感日趨重要。目前國內(nèi)對貧困大學(xué)生的關(guān)注越來越多，但對于貧困大學(xué)生自卑感的干預(yù)研究報道較少，而且缺乏有效地心理干預(yù)方法。本研究運用內(nèi)觀認知療法首次對存在自卑感的貧困大學(xué)生進行干預(yù)，評價該療法的干預(yù)效果，并探討其作用機制。方法在2012年4月對天津醫(yī)科大學(xué)部分在讀貧困生使用自卑感量表FIS進行篩查總分低于144分，其中60名貧困大學(xué)生符合條件并自愿參加本研究，簽署知情同意書，然后根究隨機數(shù)字表隨機分成兩組，對照組30例，研究組30例，研究組接受連續(xù)7天的內(nèi)觀認知療法干預(yù)NCT，對照組參加學(xué)校組織的團體心理輔導(dǎo)。在干預(yù)前和干預(yù)后各進行一次心理評估，評估工具包括自卑感量表FLS、個人評價問卷PEI、領(lǐng)悟社會支持量表PSSS、社交苦惱于回避量表SAD、自動思維問卷ATQ。結(jié)果最終研究組30例，對照組30例，進入結(jié)果分析。干預(yù)前兩組人員一般情況以及各評估指標間均無明顯差異。①研究組干預(yù)后，F(xiàn)LS總分和各因子分均較干預(yù)前明顯升高尸O01，對照組干預(yù)后FIS總分和自尊、社交自信因子分均較干預(yù)前升高JPO05，干預(yù)后研究組FIS總分和社交自信、學(xué)習(xí)能力、外貌因子分均高于對照組尸005②研究組干預(yù)后PEI得分顯著高于干預(yù)前尸001，干預(yù)后PIE得分顯著高于對照組P001③研究組干預(yù)后SAD總分和各因子的得分較干預(yù)前均明顯降低PO01，對照組干預(yù)前后SAD總分和個因子得分均無顯著性差異④研究組干預(yù)后PSSS得分較干預(yù)前升高，尸001，對照組干預(yù)前后PSSS得分無顯著性差異⑤研究組干預(yù)后ATO得分較干預(yù)前明顯降低尸O01，對照組干預(yù)前后ATQ得分無顯著性差異。結(jié)論①內(nèi)觀認知療法能夠顯著改善貧困大學(xué)生的自卑感，團體心理輔導(dǎo)對改善貧困大學(xué)生的自卑感有效，但內(nèi)觀認知療法效果更顯著；②內(nèi)觀認知療法能夠顯著提高貧困大學(xué)生自我評價，能夠客觀的看待自我的表現(xiàn)和他人的評價；③內(nèi)觀認知療法能夠改善貧困大學(xué)社交焦慮，改善人際關(guān)系；④內(nèi)觀認知療法改善貧困大學(xué)領(lǐng)悟社會支持水平；⑤內(nèi)觀認知療法顯著降低貧困大學(xué)生自

簡介：埃博拉病毒是一種絲狀病毒科單股負鏈無節(jié)段的RNA病毒。該病毒可導(dǎo)致埃博拉出血熱多表現(xiàn)為高熱、休克及出血傾向。在疾病發(fā)展過程中埃博拉病毒可損害血管內(nèi)皮進而導(dǎo)致血管通透性增加。目前己確定埃博拉病毒的毒性主要源自其表面的糖蛋白GP。內(nèi)源性表達該蛋白可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞失去粘附能力而脫落、漂浮從而損害血管的完整性。本室建立了外源性攜帶FC標簽的糖蛋白GP1亞基GP1FC導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞漂浮的模型。為進一步明確該模型中GP1FC毒性相關(guān)的結(jié)構(gòu)域本研究構(gòu)建并表達、純化了GP1相關(guān)的系列蛋白。同時發(fā)現(xiàn)了外源性添加的GP1FC蛋白以多聚體的形式存在可能存在模擬天然GP分子構(gòu)象的情況。此外本研究還證實了在293T細胞中內(nèi)源性表達GP不會直接導(dǎo)致細胞死亡。

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簡介：河北醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)的間皮素基因沉默抑制卵巢上皮性癌生長轉(zhuǎn)移的研究姓名王莉申請學(xué)位級別博士專業(yè)外科學(xué)指導(dǎo)教師吳小華20080401英文縮寫ODPBSRTPCRPVDFRNAIRPMSDSSMI心SIRNAS㈣ATEMEDDIPHENYLTETRAZRAZOLIUMBROMIDE二甲基噻唑二苯基四唑溴藍OPTICALDENSITY光密度PHOSPHATEBUFFEREDSALINE磷酸鹽緩沖液REVERSETRANSCRIPTASEOLYMERASECHAINREACTION逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)POLYVINGLIDENDIFLUORIDE聚偏二氟乙烯RNAINTERFERENCERNA干擾ROUNDSPERMINUTE每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)SODIUMDODECYLSULFATE十二烷基硫酸鈉SOLUBLEMESOTHELINRELATEDPROTEIN可溶性間皮素相關(guān)蛋白SHORTINTERFERINGRNA小干擾RNASHORTHAIRPINRNA短發(fā)卡RNAN，N，N，NTETRAMETHEYLETHYLENEDIAMINE四甲基乙二胺

簡介：目的探索SARS冠狀病毒SARSCOVS糖蛋白在真核細胞內(nèi)的表達定位及其相關(guān)功能方法分別構(gòu)建融合有綠色熒光蛋白GFP基因或HA多肽抗原基因的SARSCOVS糖蛋白全長CDNA質(zhì)粒測序得到該實驗SARSCOV樣本S糖蛋白的基因序列圖譜利用生物信息學(xué)方法分析該樣本S糖蛋白的基因序列尋找到新的突變位點繪制進化樹通過預(yù)測S糖蛋白的普通物理化學(xué)性質(zhì)為下一步實驗提供相關(guān)信息和指導(dǎo)利用非病毒性載體轉(zhuǎn)染HELA細胞在激光共聚焦熒光掃描顯微鏡下觀察融合了GFP的SARSCOVS糖蛋白SGFP的亞細胞定位同時利用SARS患者康復(fù)血清和HA抗體進行蛋白印跡雜交確定SARSCOVS糖蛋白在真核細胞中的存在形式結(jié)果成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒GFPSPCSSGFPPCSHASPCDNASHAPCS分別將GFP基因或HA多肽抗原基因融合到SARSCOVS糖蛋白基因的N端和C端通過生物信息學(xué)分析預(yù)測SARSCOVS糖蛋白基因具有高度的突變能力其分子量大小為139KD等電點PI為554在哺乳動物細胞內(nèi)表達穩(wěn)定并具有兩個螺旋化螺旋結(jié)構(gòu)COILEDCOIL在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)通過非病毒載體轉(zhuǎn)染的SGFP融合蛋白的熒光彌散于整個HELA細胞內(nèi)尤以細胞核區(qū)和胞漿區(qū)較為密集而沒有集中定位于細胞膜上這種定位分布不隨蛋白表達時間延長而發(fā)生顯著變化蛋白印跡雜交顯示在7090KD的區(qū)域有特異性條帶結(jié)論利用非病毒性載體在HELA細胞中表達的SGFP融合蛋白主要分布于真核細胞核及胞漿內(nèi)少量定位于細胞膜上SARSCOVS糖蛋白在HELA細胞中不是以完整形式存在有被蛋白酶切割的可能性

簡介：目的觀察大鼠脊髓損傷后皮層體感運動區(qū)CDH1MRNA的表達變化，探討慢病毒介導(dǎo)RNA干擾CDH1的表達對脊髓損傷修復(fù)的作用。方法20只雄性成年健康SD大鼠隨機分為正常對照組和手術(shù)組（1WK組、2WK組），手術(shù)組采用ALLEN氏法在T10T11建立脊髓打擊損傷模型，正常對照組僅咬除T10椎板。1WK、2WK后分別取大鼠前囟后體感運動皮層區(qū)域，然后提取組織總RNA，采用實時熒光定量PCR檢測CDH1MRNA的表達變化。另30只雄性成年SD大鼠隨機分為生理鹽水注射組（A組，N10），空慢病毒注射組（B組N10）和重組慢病毒注射組（C組，N10）。3組均采用改良ALLEN氏法建立脊髓打擊損傷模型，術(shù)后1WK分別在大鼠前囟后體感運動皮層區(qū)注射生理鹽水、空慢病毒和重組慢病毒，注射10D后每組取5只采用實時熒光定量PCR檢測法檢測CDH1MRNA的表達并且在術(shù)后不同時間點對大鼠進行運動功能采用BASSOBEATTIEBRESNAHANBBB評分標準評估，術(shù)后第6WK用同樣的方法在原皮層區(qū)域注射10％BDATR（BIOTINYLATEDDEXTRANAMINETEXASRED）。術(shù)后8WK處死并用4％多聚甲醛灌注固定取脊髓損傷區(qū)域作冰凍連續(xù)縱切片熒光顯微鏡下直接觀察。結(jié)果大鼠脊髓損傷后1WK和2WK前囟后體感運動皮層區(qū)域的CDH1MRNA的表達均高于對照組（P結(jié)論大鼠脊髓損傷后CDH1MRNA的表達明顯升高，通過下調(diào)CDH1的表達能促進軸突的生長，提示CDH1是具有抑制軸突生長的功能。

簡介：目的通過過表達趨化因子受體4CXCR4基因修飾的人臍帶間充質(zhì)干細胞HUCMSCS的建立，體外觀察HUCMSCS細胞遷移，探討SDF1ΑCXCR4軸介導(dǎo)的HUCMSCS細胞遷移，以證實SDF1ΑCXCR4在細胞遷移過程中的作用。方法提取WISTAR大鼠大腦組織總RNA通過RTPCR獲取CDNA文庫據(jù)GENEBANK獲得大鼠CXCR4編碼區(qū)全長序列，按照慢病毒載體酶切位點，設(shè)計CXCR4上下游引物，通過聚合酶聯(lián)反應(yīng)PCR獲得CXCR4基因片段，與雙酶切線性化的慢病毒載體質(zhì)粒PCDH1MCSEF1COPGFP連接，完成過表達CXCR4的慢病毒載體質(zhì)粒（PCDH1CXCR4EF1COPGFP）的構(gòu)建包裝慢病毒，并采用流式細胞儀測定慢病毒滴度利用慢病毒感染HUCMSCS，建立過表達CXCR4的人臍帶間充質(zhì)干細胞群LENTIGFPCXCR4HUCMSCS采用TRANSWELL實驗觀察細胞群遷移，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果WISTAR大鼠CDNA文庫構(gòu)建成功，通過PCR擴增獲得大鼠CXCR4基因片段為1050BP，與PCDH1MCSEF1COPGFP連接成功，轉(zhuǎn)化獲得過表達CXCR4的慢病毒載體質(zhì)粒PCDH1CXCR4EF1COPGFP，包裝攜帶GFP的過表達CXCR4的第三代慢病毒成功，滴度為789105TCID50ML?？筛腥綡UCMSCS獲得LENTIGFPCXCR4HUCMSCS，熒光顯微鏡觀察示GFP表達可超過90％，經(jīng)體外培養(yǎng)傳代，REALTIMEPCR及WESTERNBLOT檢測CXCR4表達持續(xù)增高，且不隨傳代次數(shù)增加而降低，與感染前HUCMSCS相比有統(tǒng)計學(xué)差異。TRANSWELL小室檢測證明隨著SDF1Α濃度增高，LENTIGFPCXCR4HUCMSCS遷移率比HUCMSCS遷移率逐漸增高，P＜005，有統(tǒng)計學(xué)差異。SDF1Α的趨化作用可被CXCR4的特異性抑制劑AMD3100阻斷。結(jié)論過表達CXCR4慢病毒可感染HUCMSCSLENTIGFPCXCR4HUCMSCSCXCR4MRNA及蛋白表達含量均持續(xù)增高SDF1Α主要通過CXCR4發(fā)揮趨化作用，且細胞遷移率呈現(xiàn)出SDF1Α濃度依賴性，這種趨化作用可被AMD3100阻斷本實驗采用體外實驗，排除SDF1Α之外的非研究因素影響，更具針對性研究SDF1ΑCXCR4軸介導(dǎo)的HUCMSCS靶向細胞遷移，為HUCMSCS靶向細胞遷移修復(fù)組織損傷提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

簡介：鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文人乳頭瘤病毒檢測及分型基因芯片制備的初步研究姓名趙虎申請學(xué)位級別碩士專業(yè)婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師鄭英20040420鄭州大學(xué)碩士研究生論文2004人乳頭瘤病毒檢測及分型基因芯片制備的初步研究材料和方法收集尖銳濕疣50例和宮頸癌22例石蠟包埋組織標本，用酚氯仿抽提法從中提取DNA，用HPVPCR檢測試劑盒對其進行IIPV檢測，對結(jié)果陽性者進行純化、重組克隆，經(jīng)DNA序列測定，檢索GENBANK，保留HPV6，11，16，18陽性克隆為標準品。根據(jù)HPVL1區(qū)基因序列特點，設(shè)計5條實驗組探針ⅢV通用探針、HPV6，11，16，18型特異性探針各一條和3條對照組探針與HPV沒有同源性的一段植物基因為陰性對照，一段乙肝基因片段為陽性對照，不含任何基因片段的空白點樣液為空白對照，用GMS417ARRAYER點樣儀將其點樣至經(jīng)特殊處理過的玻片上，制成HPV檢測及分型基因芯片。采用PER引物直接標記法和摻入法對HPV標準品進行擴增和熒光標記，將標記好的標準品與芯片在梯度溫度下43。C，45。C，47。C，49。C，51℃雜交L小時，用GMS418ARRAYSCANNER掃描儀對雜交后的芯片進行掃描檢測分析，用SCAN泌RAY軟件對各信號點進行信號強度采集。采用SPSSL00軟件對不同標記方法、不同雜交溫度下信號強度的差異性進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用T檢驗，以A005為檢驗標準，確定該芯片的最佳雜交溫度和樣品的最佳標記方法。結(jié)果1對石蠟包埋組織標本中HPVPCR擴增陽性產(chǎn)物，進行重組克隆，經(jīng)測序驗證，構(gòu)建了HPV6，11，16，18的標準品質(zhì)粒。、2對于本研究制作的芯片，PCR引物直接標記法的標記效率明顯高于摻入法，兩者的信號強度差異具有顯著性PO01。J3各HPV標準品與本研究制作的芯片雜交，雜交溫度為43℃和45℃時存在交叉錯配信號；雜交溫度為5L℃時，無雜交信號；雜交溫度為47。C和49℃時既無交叉錯配信號，且各標準品與相應(yīng)探針均有雜交信號；47“C下的雜交信號強度、、明顯強于49℃時，兩盞的雜交信號強度差異具有顯著性P001。L●4采用PCR引物直接標記法對樣品進行標記，雜交溫度為47。C時，各HPV標準品與芯片的雜交圖譜為標準圖譜，即監(jiān)控系統(tǒng)信號正常即陽性對照有雜交信號而陰性對照和空白對照無雜交信號且各HPV標準品與芯片雜交時，在其相應(yīng)探針位點和通用探針位點出現(xiàn)陽性信號，各型別之間無交叉錯配信號。

簡介：腸道病毒71型ENTEROVIRUSTYPE71簡稱EV71是手足口病HFOOTMOUTHDISEASEHFMD的主要病原體其感染性強且致病率高可以導(dǎo)致手足口病、無菌性腦膜炎ASEPICMENINGITIS、腦炎ENCEPHALITIS和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹性疾病POLIOMYELITISLIKEPARALYSIS等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。EV71傳染性強常見全家發(fā)病并可造成局部暴發(fā)流行?；颊咭?～5歲以下小兒多見成人也可患病但病情多較輕。一年四季均可發(fā)病以5、6月份為多發(fā)。潛伏期2～5日。傳播途徑不僅是糞口傳播病毒主要通過人群間的密切接觸進行傳播人群密集處易發(fā)生病毒的流行幼托機構(gòu)內(nèi)的學(xué)齡前兒童是感染的高危人群。進入21世紀以來EV71引起的手足口病疫情在我國及世界多個國家和地區(qū)多次大規(guī)模出現(xiàn)對人類健康、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定造成了嚴重的危害。EV71可感染免疫缺陷者、新生兒及幼兒造成嚴重后果甚至威脅生命。由于是EV71引起的手足口病與柯薩奇A組和B組的一些病毒引起的手足口病在臨床上難以區(qū)分而且COX16爆發(fā)往往伴隨著EV71的流行而且EV71可引起的臨床癥狀與其他病毒引起的初期癥狀極為相似因此EV71是所有腸道病毒中最難鑒定的病毒之一。因此早期、快速、準確的診斷對EV71的預(yù)防和隔離至關(guān)重要。目前常用的實驗室診斷方法包括病毒分離培養(yǎng)、免疫學(xué)方法、PCR技術(shù)等但分別存在難以早期診斷、敏感度低或假陽性率高等缺陷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展基因芯片技術(shù)因其具有高通量性、快速、準確性強等特點成為新興的病毒檢測技術(shù)。本課題研究借助生物信息學(xué)技術(shù)和探針設(shè)計軟件探索對EV71病毒感染的早期、敏感、準確和快速檢測的探針設(shè)計為以后打印成適用的基因檢測芯片打下基礎(chǔ)?；蛐酒夹g(shù)是近年發(fā)展起來的一種新型、高效、快速、敏感的核酸分析與檢測方法基因芯片技術(shù)因其具有高通量性、快速、準確性強等特點成為新興的病毒檢測技術(shù)。目前國內(nèi)尚無使用基因芯片對腸道病毒進行檢測的相關(guān)報道。鑒于腸道病毒引發(fā)疾病的早期診斷對后期的疾病防治工作意義重大可使用基因芯片技術(shù)針對并發(fā)癥較嚴重之EV71、COXA15、COXA16、COXB3等多種腸道病毒的特定基因序列所設(shè)計出檢測芯片快速診斷腸道病毒感染的具體類型及時制定治療措施提高疾病防治水平。因此使用基因芯片技術(shù)對腸道病毒進行聯(lián)合檢測的臨床應(yīng)用前景非常廣闊。近年來迅速發(fā)展的長鏈寡核苷酸基因芯片技術(shù)6070MEROLIGOMICROARRAY為從基因水平高度特異性的檢測EV71提供了可能。長鏈寡核苷酸探針用作基因芯片探針是近年來在基因芯片研究領(lǐng)域出現(xiàn)的一項新技術(shù)生物信息學(xué)研究表明一條長鏈寡核苷酸即可代表一個基因同時又具有較高的特異性因此長鏈寡核苷酸探針集傳統(tǒng)CDNA和短鏈寡核苷酸探針的優(yōu)點于一身在一定程度上克服了傳統(tǒng)探針的缺點是制作EV71檢測芯片最合適的選擇。通過生物信息學(xué)研究分析基因芯片探針是一種簡便經(jīng)濟的方法運用生物信息學(xué)工具對基因芯片探針進行設(shè)計可以大大減少花費時間、提高工作效率。運用生物信息學(xué)方法從核酸數(shù)據(jù)庫中取得基因序列然后通過序列比對分析找出其特征序列作為探針設(shè)計的參照序列。序列比對分析是生物信息學(xué)中最常用的方法生物信息學(xué)中常用的核酸序列搜索比較算法是BLAST。各種亞型的基因組序列存在堿基插入、缺失和替換而導(dǎo)致的細微差別。利用多重序列比較可以發(fā)現(xiàn)基因序列中相對保守的區(qū)域因此可以選擇這段保守區(qū)作為芯片設(shè)計的參考序列。用生物信息學(xué)探針設(shè)計軟件分析保守序列即可獲得特異探針。本研究首先確立了長鏈寡核苷酸基因芯片實驗的基本條件以保證各種參數(shù)盡量控制在最佳范圍以保證在同一張芯片上的探針在相同的雜交、清洗條件下得到最佳的雜交效果并確定了用于寡核苷酸芯片雜交檢測所需要的最佳探針片段長度。長鏈寡核苷酸探針序列長度一般在60170MER60MER的探針盡管合成成本較低但特異性及固定率均不如70MER長度的探針由于70MER的寡核苷酸芯片能兼顧雜交的特異性和信號強度已經(jīng)被越來越多的實驗室所接受。本研究首先登錄NCBINATIONALCENTERFBIOTECHNOLOGYINFMATION網(wǎng)站GENBANK數(shù)據(jù)庫通過搜索獲得最新的EV71基因組全長序列然后將病毒的基因組全長序列使用NCBI的在線BLASTBASICLOCALALIGNMENTSEARCHTOOL功能進行BLAST比對分析結(jié)果獲得EV71的保守序列及型特異性序列作為設(shè)計OLIGO探針的備選序列。利用生物學(xué)軟件OLIGO671分別對BLAST檢索所得病毒的種屬保守序列和型特異性序列逐一進行分析設(shè)計長度均一的70MER的OLIGO探針并對其進行BLAST比對為減少非特異性雜交保證芯片雜交的敏感度和精確度采用了嚴格的遴選標準從中篩選出特異性較高的12條探針作為制備EV71寡核苷酸檢測基因芯片的首選探針序列。本研究使用生物信息學(xué)方法對EV71的基因序列進行比對得到有意義的特異序列；用生物學(xué)軟件OLIGO671為基因芯片設(shè)計特異性高、TM值相近、長度均一的OLIGO探針為基因芯片在臨床診斷中的應(yīng)用作出了貢獻。本課題通過實驗室研究得到的實驗結(jié)果如下1、使用基因芯片技術(shù)對EV71進行診斷其主要優(yōu)點是可以同時檢測多段基因而且具有較高的靈敏度。同時由于分子雜交本身即具有較高的嚴謹性應(yīng)用多組探針聯(lián)合判斷檢測結(jié)果也可以有效的降低檢測的假陽性率。此外因基因芯片本身具備高通量大規(guī)模的特點將基因芯片用于鑒別診斷最有優(yōu)勢可以將多種與EV71早期癥狀類似的病毒如柯薩奇、皰疹病毒、?？刹《?、輪狀病毒等常見病原體點樣到芯片上進行聯(lián)合診斷對于確診病人、排除疑似患者具有重要意義。設(shè)計出能與靶分子特異結(jié)合的探針是準確檢測病毒基因的關(guān)鍵。用于病原體檢測或診斷的寡核苷酸探針可針對病原體基因的保守序列或是與疾病相關(guān)的特異基因來進行設(shè)計。長鏈寡核苷酸探針序列長度一般在6070MER60MER的探針盡管合成成本較低但特異性及固定率均不如70MER長度的探針；由于70MER的寡核苷酸芯片能兼顧雜交的特異性和信號強度在本研究中我們采用了70MER的探針序列。2、本研究首先直接通過生物信息學(xué)軟件從網(wǎng)上GENBANK等數(shù)據(jù)庫調(diào)取目標序列然后構(gòu)建分析項目再分別對各基因的基因序列進行全長比對通過比對后再進行探針設(shè)計就能避免探針的交叉同源性。在進行探針設(shè)計時可據(jù)比對結(jié)果剔除同源性高的區(qū)段低的區(qū)段再行二次甚至三次比對并選擇再次比對結(jié)果中相似性分選擇再次比對結(jié)果中相似性分數(shù)值3、在用OLIGO671對探針進行設(shè)計時選擇70MER長度均一的OLIGO作為探針可使雜交條件趨向均一靈敏度增高。對備選探針進行篩選時各種參數(shù)盡量控制在最佳范圍以保證同一張芯片上的探針在相同的雜交、清洗條件下得到最佳的雜交效果。探針最穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的配對堿基長度小于6BPG趨于0或為正值保證探針內(nèi)部不會形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)而影響探針與芯片雜交的效率。本研究利用NCBI網(wǎng)站中的GENBANK數(shù)據(jù)庫的BLAST功能及生物學(xué)軟件OLIGO671成功設(shè)計特異性高、長度一致、融解溫度相近的OLIGO探針12條為后期合成基因芯片用于EV71的檢測打下了基礎(chǔ)可以較好的用于進一步的芯片實驗階段。綜上所述基因芯片具有大規(guī)模、高通量、高度敏感與高度特異性等特點在感染性疾病病原體的確定以及進一步的鑒別診斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。利用NCBI網(wǎng)站中的GENBANK數(shù)據(jù)庫的BLAST功能和生物學(xué)軟件OLIGO671設(shè)計EV71基因診斷芯片探針是一種簡便可行、有效的方法為后期合成基因芯片用于EV71的檢測打下了基礎(chǔ)可以較好的用于進一步的芯片實驗階段。

簡介：目的在體外評估CELECOXIB聯(lián)合ZD55IL24選擇性殺傷尿路上皮細胞癌細胞的能力，探討膀胱癌治療的新方法。方法MTT法檢測CELECOXIB不同濃度，不同時間對T24和HUVEC細胞的生長抑制。相差顯微鏡觀察CELECOXIB對細胞凋亡的影響。熒光顯微鏡下觀察ZD55EGFP對T24和HUVEC細胞的轉(zhuǎn)染效率。RTPCR法測定IL24MRNA在不同細胞中的表達情況。MTT法檢測CELECOXIB聯(lián)合ZD55IL24對T24和HUVEC細胞增殖的抑制作用。流式細胞術(shù)檢測其對T24和HUVEC凋亡的影響。所得數(shù)據(jù)使用SAS統(tǒng)計軟件分析。結(jié)果CELECOXIB對T24細胞有明顯抑制作用，而對HUVEC細胞抑制作用不明顯。這種抑制有劑量和時間依賴性。同HUVEC細胞組、空白組比較有統(tǒng)計學(xué)意義P結(jié)論CELECOXIB對尿路上皮癌T24細胞具有明顯的生長抑制作用，且抑制作用具有時間劑量依賴關(guān)系。ZD55能夠轉(zhuǎn)染T24尿路上皮癌細胞和HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細胞，但對T24細胞具有較高轉(zhuǎn)染效率。ZD55IL24轉(zhuǎn)染后T24細胞能持續(xù)穩(wěn)定表達IL24。與單一藥物相比，CELECOXIB聯(lián)合ZD55IL24能最大程度地抑制T24細胞的增殖和促進凋亡，而對HUVEC影響較小。提示兩者有協(xié)同抗腫瘤作用，而對正常細胞安全，對腫瘤細胞有良好的靶向性。

簡介：Y一氨基丁酸對小鼠焦慮樣行為及認知功能的影響碩士研究生龔雪導(dǎo)師陳英輝主任醫(yī)師導(dǎo)師組成員許國雄研究員施曉紅副主任醫(yī)師李炳助理研究員復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院二零一三年八月復(fù)旦太堂亟±堂僮迨塞笪喳翊垂ADHDGABAGATLGA『】『LKOGAT．1／GAL乙L7。GAT1HETEHOMOIJTPNCTBSWT縮略詞表ABBREVIATIONATTENTIONDEFICITHYPERACTIVITYDISORDERGAMMAAMINOBUTYRICACIDGAMMAAMINOBUTYRICACIDTRANSPORTER1GATLLKNOCKOUTGAT1WILDTYPEGAT1KNOCKOUTHETEROZYGOTEGAT1KNOCKOUTHOMOZYGOTYHETEROZYGOTEHOMOZYGOTELONGTERMPOTENTIATIONNORMALCONTROLTHETABURSTSTIMULATIONWILDTYPE注意缺陷多動障礙Y一氨基丁酸Y一氨基丁酸轉(zhuǎn)運體1GAT1敲除GAT1野生型GAT1敲除雜合子GAT1敲除純合子雜合子純合子長時程增強正常對照0節(jié)律刺激誘導(dǎo)野生型

簡介：授予單位代碼學(xué)號或申請?zhí)?0459200612044100204001級公開文學(xué)論大位州學(xué)鄭士碩科學(xué)學(xué)位以GFP為報告基因的多基因共表達慢病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建院系名稱第一附屬醫(yī)院學(xué)科門類醫(yī)學(xué)專業(yè)名稱神經(jīng)病學(xué)作者姓名劉景偉導(dǎo)師姓名、職稱許予明韓志強教授2009年05月23日鄭州大學(xué)2009屆碩士學(xué)位論文中文摘要1現(xiàn)有慢病毒載體PLKO一1一PURO的多克隆位點的改建設(shè)計并合成新的多克隆位點AGEL、EEORI、XBAL、SALL和MLUX序列，退火后連接到經(jīng)AGEL和EEORI雙酶切的PLKO1一PURO載體質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒PLKO一1一PURO一MCS轉(zhuǎn)化大腸桿菌ESEHERIEHIAEOLI，EEOLINH5A感受態(tài)細胞，篩選陽性菌落、擴增后提取質(zhì)粒，MLUL和BAMHI雙酶切鑒定。2EMV啟動子一OFP一IRES一MES元件克隆至PLKO一L一PURO一MCS以PGFP一IRES為模板設(shè)計引物，用高保真DNA聚合酶擴增出約24KB片段，XBAL和SALL酶切后克隆至PLKO一L一PURO一MCS的乃AL和SALL位點處，XBAL和}SALL酶切鑒定。3配套質(zhì)粒PSISHUTLE的構(gòu)建設(shè)計INPTENI和州PTENZ引物，PCR擴增PSILENCER20，得到42LBP片段，將其克隆至PENT凡U6一EON，得PSI一SHUTLE，SALL和XBAL酶切鑒定陽性菌落。4用脂質(zhì)體2000將重組載體質(zhì)粒PLKO一M、輔助質(zhì)粒PCMVDRS2DVPR和包膜質(zhì)粒PCMVVSVG共同轉(zhuǎn)染293T細胞，產(chǎn)生具有感染能力的慢病毒顆粒，在25000RPM、4OC條件下離心GOMIN濃縮病毒顆粒。5TCIDS。法測定慢病毒滴度將病毒顆粒進行系列稀釋后感染2個孔板內(nèi)、七RO細胞，48小時后在倒置熒光顯微鏡下計數(shù)產(chǎn)生綠色熒光的孔數(shù)并計算滴度。結(jié)果1含新的多克隆位點MCS的寡核營酸鏈被成功克隆到慢病毒載體質(zhì)粒PLKO小PURO中，得PLKO小PURO一MCS，經(jīng)過酶切鑒定證明構(gòu)建成功。2EMV啟動子一GFP一IRES一MES元件被成功克隆至PLKO一L一PURO一MCS，酶切鑒定正確。3PSILENCERZO質(zhì)粒上的SIRNA表達盒被成功克隆至PENTR一U6一CON，酶切和測序鑒定正確。4三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T48小時后可見GFP表達，72小時后收獲慢病毒顆粒并進行了濃縮。5將濃縮后的病毒系列稀釋后感染2個孔板內(nèi)、飛RO細胞，48小時后出現(xiàn)綠色熒光，用TCIDS。法計算得出濃縮后的病毒感染單位IU均值為647X1O“IU/ML。