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簡介：本研究依據(jù)成就目標的四分結(jié)構(gòu)理論，采取實驗室實驗的方法設(shè)置了非評估性情境和評估性情境，通過實驗者指定成就目標定向的方式引導被試進入特定的成就目標狀態(tài)，以考察成就目標對個體認知作業(yè)成績和情緒感受的影響。研究一考察在非評估性情境下，成就目標定向?qū)€體認知作業(yè)成績和情緒感受的影響，以了解在“無壓力情境”下四種成就目標分別會導致哪些認知和情感反應；研究二考察在非評估性情境和評估性情境兩種條件下，成就目標對個體認知作業(yè)成績和情緒感受的影響，以探討壓力情境會給不同的成就目標造成什么樣的影響。結(jié)果表明⑴在非評估性情境下，成就目標對個體認知作業(yè)成績沒有顯著性影響；在情緒感受方面，四種成就目標所引起的生理喚醒程度不存在顯著差異，但情緒感受的性質(zhì)有顯著區(qū)別掌握趨近目標和成績趨近目標愉快程度最高，成績回避目標焦慮程度最高。⑵在個體經(jīng)歷非評估情境和評估性情境兩種條件時，評估性情境下的認知作業(yè)成績高于非評估情境下的認知作業(yè)成績，但是成就目標對個體在兩種情境下認知作業(yè)成績變化的影響不顯著；在情緒主觀感受方面，評估性情境下掌握趨近目標的興奮度最高，掌握回避目標的興奮度最低，四種成就目標在焦慮程度和愉快程度上沒有顯著差別。在情緒的生理喚醒程度上，評估性情境下個體的生理喚醒程度比非評估性情境下顯著升高，而四種成就目標之間沒有出現(xiàn)顯著性差異。⑶在非評估性情境和評估性情境兩種條件下，任務卷入程度同個體主觀情緒感受均存在正向相關(guān)的關(guān)系。

簡介：目的建立基于TAQMAN探針的實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測與定量輪狀病毒G4型VP7基因的方法。方法輪狀病毒ROTAVIRUS，RV是5歲以下兒童重癥腹瀉最主要的病原體，其感染引起的死亡占兒童死亡數(shù)的5％，其中90％發(fā)生在發(fā)展中國家。WHO推薦所有國家的免疫程序中應當包含輪狀病毒疫苗，以預防輪狀病毒感染。實時定量PCRPOLYMERASECHAINREACTION可連續(xù)收集一只或多只PCR管中每個循環(huán)的熒光信號，該信號與模板的拷貝數(shù)相關(guān)。一個完美的定量PCR其斜率為332，對應的擴增效率為100％，截距在33到37個循環(huán)之間且R2為100。本試驗目的是建立一種基于TAQMANR探針的快速、準確、特異的RV熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法，用于RVG4型VP7基因的檢測及定量。使用RTPCRREVERSETRANIONPCR以輪狀病毒G4型VP7基因為模板設(shè)計引物和探針，探針5端距離上游引物3端8BP，使用JOE標記探針3端報告基團，5端標記ECLIPE淬滅基團。從輪狀病毒G4型中擴增出VP7基因，將該基因構(gòu)建于質(zhì)粒并克隆培養(yǎng)。從質(zhì)粒中擴增并純化的VP7DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄RNA。將該RNA純化并使用光度法定量，稀釋RNA至102107拷貝ΜL數(shù)量級作為RTQPCRREALTIMEQUANTITATIVEPCR標準品，優(yōu)化PCR體系，通過絕對定量法測定樣品中G4型病毒RNA拷貝數(shù)。結(jié)果所獲得的RNA標準品純度高，可以用于G4型輪狀病毒的檢測和定量。建立的擴增體系具有寬廣的動態(tài)范圍，擴增效率大于90％，所構(gòu)建標準曲線R2大于098；相比普通的RTPCR方法，定量PCR靈敏度提高了約一個數(shù)量級，可輕易自100拷貝ΜL數(shù)量級樣本中檢出目的基因，試驗重復性好，特異、靈敏。結(jié)論基于TAQMANR探針的RTQPCR可以特異、靈敏的檢測和定量細胞培養(yǎng)物中的輪狀病毒G4型VP7基因。

簡介：中圖法分類號R734學校代碼10661學號2012399密級公開碩士學位論文碩士學位論文（專業(yè)型學位）人BMIBMI1基因基因SHRNASHRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建、慢病毒表達載體的構(gòu)建、病毒的濃縮及其病毒滴度的測定病毒的濃縮及其病毒滴度的測定姓名名羅逸專業(yè)業(yè)腫瘤學研究方向研究方向頭頸部腫瘤的綜合治療頭頸部腫瘤的綜合治療導師師鄒彥培養(yǎng)單位培養(yǎng)單位遵義醫(yī)學院2015年4月目錄1、論文人BMI1基因SHRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建、病毒的濃縮及其病毒滴度的測定中英縮略詞對照表1中文摘要2英文摘要3前言4材料與方法6結(jié)果12討論19結(jié)論20參考文獻212、綜述233、致謝324、作者簡介34基金課題編號遵義市匯川區(qū)課題

簡介：上海交通大學碩士論文SHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITYMASTER’STHESISANANIMALMODELOFEPSTEINBARRVIRUSASSOCIATEDHEMOPHAGOCYTICLYMPHOHISTIOCYTOSISINHUMANIZEDNOD/SCIDMICEANDANALYSISOFPROGNOSISOFCHILDRENWITHHEMOPHAGOCYTICSYNDROMENAMEXUDONGQINGNUMBER1117229025TUTORYUANXIAOJUNDECIPLINEPEDIATRICSDATE2014429XINHUAHOSPITALAFFILIATEDTOSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITYSCHOOLOFMEDICINE上海交通大學碩士論文

簡介：人乳頭瘤病毒HUMANPAPILLOMAVIRUS，HPV感染能引起宮頸癌、生殖器疣等多種性傳播疾病，嚴重危害著人類健康。由于HPV的生活周期依賴于上皮細胞的分化，傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法不能實現(xiàn)HPV的擴增，同時從病人組織中分離的病毒也極其有限，這制約了HPV的分子生物學研究和HPV疫苗的保護性評價。研究人員已經(jīng)發(fā)展出多種系統(tǒng)以克服病毒來源不足的限制通過組織移植和筏式組織培養(yǎng)擴增一些HPV型的病毒，以及用重組痘病毒、腺病毒、酵母表達構(gòu)建HPV假病毒。但是這些病毒假病毒生產(chǎn)方法的操作較復雜，效率均不高，無法滿足大量試驗的需要。本論文利用HPV研究方面的新進展，結(jié)合本研究中心的實際條件，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法將含HPV優(yōu)化基因的質(zhì)粒和報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，成功構(gòu)建獲得了高滴度的感染性HPV16、HPV18、HPV6和HPV11四種假病毒，電鏡觀察證實獲得的假病毒具有與天然病毒相同的形態(tài)，隨后用標準中和單抗進行的鑒定證實假病毒具有與天然病毒相似的感染性。這些結(jié)果說明獲得的假病毒可以替代天然病毒用于HPV生物學研究和HPV候選疫苗的保護性評價。我們用獲得的四種假病毒對29種哺乳動物細胞進行了感染比較。發(fā)現(xiàn)HPV16和HPV18假病毒有很廣的細胞嗜性，能感染人、嚙齒動物和猴不同組織的多種細胞系；HPV6和HPV11假病毒能感染人的多種細胞系，但是基本不感染嚙齒動物和猴的細胞。該結(jié)果暗示“高危”型HPV和“低?！毙虷PV對細胞的感染機制可能不同?；诙嗉毎腥窘Y(jié)果，我們選擇293FT細胞作為假病毒感染靶細胞，建立了假病毒中和模型。本實驗室已經(jīng)篩選獲得了HPV16、HPV18和HPV6的單抗各幾十株，我們用假病毒感染中和試驗從中鑒定出17株HPV16中和單抗、9株HPV18中和單抗和22株HPV6中和單抗。滴度最高的16株HPV6中和單抗有12株能阻斷HPV11假病毒的感染，其中5株單抗對HPV11假病毒的中和滴度能達到104以上，表明HPV6和HPV11具有共同的中和表位。鑒定出的這些中和單抗對于全面鑒定HPV中和表位和HPV疫苗質(zhì)控均有較大的幫助。另外，用假病毒中和模型對本實驗室研發(fā)的HPV16、HPV18和HPV6VLP候選疫苗的免疫保護性進行了鑒定。中和試驗結(jié)果表明，HPV16、HPV18、HPV6VLP在小鼠、家兔和山羊中均能誘導出很強的中和抗體應答，具有很好的疫苗應用前景。尤其值得注意的是，兔和山羊的HPV6VLP免疫血清能有效阻斷HPV11假病毒的感染，提示該HPV6VLP候選疫苗可能對HPV11也具有交叉保護性。我們進一步用不同劑量的HPV16VLP候選疫苗免疫了80只小鼠，測得該候選疫苗的中和抗體ED50值為00136ΜG，為下一步臨床試驗所需的合適劑量提供了參考。

簡介：病毒感染所引起的呼吸道疾病已經(jīng)成為世界性的常見疾病之一。人博卡病毒（HBOV）作為引起呼吸道感染的常見病毒之一，雖然發(fā)現(xiàn)相對較晚，但受到科研工作者的廣泛關(guān)注。而有效的診斷和治療需要具有高效價的抗體，才能建立系統(tǒng)的方法，單克隆抗體是病原檢測和診斷的主要工具。目前，有關(guān)HBOV單克隆抗體制備的研究很少，因此，HBOV單克隆抗體的制備對于HBOV的診斷和所引起的疾病的治療有重要意義。本研究利用強大的原核表達載體PET30A構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過大腸桿菌表達系統(tǒng)表達重組VP2蛋白，通過柱上變復性純化目的蛋白。利用血清檢查抗原。以純化蛋白作為抗原，免疫小鼠，利用雜交瘤技術(shù)及間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞，小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生單克隆抗體，并對單克隆抗體進行鑒定。結(jié)果表明，構(gòu)建出HBOVVP2基因的重組質(zhì)粒，表達并純化得到了重組HBOVVP2蛋白，利用呼吸道感染患者血清檢測抗原，陽性率為777％，與國內(nèi)外檢出率基本一致，說明抗原較好。利用雜交瘤技術(shù)篩選得到了穩(wěn)定細胞株，該細胞株可以分泌單克隆抗體。利用該株細胞在小鼠腹部誘導產(chǎn)生具有單克隆抗體的腹水，根據(jù)檢測和鑒定，所產(chǎn)生的單克隆抗體為IGG抗體，具有較好抗原抗體結(jié)合能力，效價達到14105。本實驗得到的單克隆抗體，有益于對HBOV的深入研究。該研究結(jié)果對HBOV診斷、治療和進一步研究奠定基礎(chǔ)。

簡介：華中科技大學碩士學位論文PGCFU存活素慢病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建姓名高斯媛申請學位級別碩士專業(yè)內(nèi)科學傳染病指導教師齊俊英教授201005華中科技大學碩士學位論文華中科技大學碩士學位論文4學功能研究。3將病毒感染小鼠原代肝細胞結(jié)果結(jié)果1雙酶切及測序證實從YACI中獲得的SURVIVIN基因連接到PCDNA31質(zhì)粒上，除第317位堿基由腺苷酸突變?yōu)樾叵汆奏ね?，其余都與NCBI基因文庫中SURVIVIN基因切合，該突變不影響蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)生理功能。2構(gòu)建好的PGCFUSURVIVIN表達質(zhì)粒的陽性克隆菌株轉(zhuǎn)染293T細胞后熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光，WESTERNBLOTTING結(jié)果見一與標準品大小相同的條帶。在293T細胞中進行病毒包裝，最終純化出PGCFUSURVIVIN慢病毒顆粒。3PGCFUSURVIVIN質(zhì)?？沙晒Ω腥拘∈笤渭毎?，但因感染率仍未達到滿意要求，目前仍在改進。結(jié)論結(jié)論借助T載體及PCDNA31質(zhì)粒，成功在PGCFU慢病毒表達質(zhì)粒上建立了PGCFUSURVIVIN慢病毒表達質(zhì)粒。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞肝衰竭；存活素；PGCFU

簡介：點擊查看更多護理人員和患者對護理文化認知差異的比較研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：重慶醫(yī)科大學碩士學位論文腺病毒介導NGF對大鼠周圍神經(jīng)損傷的療效研究姓名陳渝申請學位級別碩士專業(yè)外科學（骨科）指導教師黃朝梁王大勇20070401重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文TCID50DNTPDABPCNSTMDDL420ACMMBISAPSDSTEM匣DDDTAABPBMETWEENTISSUECULTILREINFECTIOUSDO∞50DEOXYRIBONUCLEOSIDETRIPHOSPHATEDIAMINOBENZIDINEPENICILINSTMYCINDEIONIZEDWATERACRYLAMIDEMETHYLENEBISAERYLAMIDEAMNLONIURNPERSULFATESODIUMDODECYLSULPHATETETRAMETHYLETHYLENEDIAMINEDITHIOTHREITOLAMINOETHANOICACIDBROM洲ORPHENOLBLUEMETHANOLNONIONICSURFACEACTIVEAGENT250％組織培養(yǎng)感染劑量三磷酸脫氧核苷二氨基聯(lián)苯胺青霉素鏈霉素去離子水丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺過硫酸銨十二烷基硫酸鈉四甲基乙二胺二硫蘇糖醇甘氨酸溴酚藍甲醇非離子型表面活性劑

簡介：自2012年起，一種新型冠狀病毒中東呼吸綜合征冠狀病毒DLEEASTRESPIRATYSYNDROMECONAVIRUS，MERSCOV持續(xù)在中東地區(qū)蔓延，已造成上百例感染病例，致死率高達50％。這是繼2003年爆發(fā)的嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒SEVEREACUTERESPIRATYSYNDROMECONAVIRUS，SARSCOV、2004年發(fā)現(xiàn)的人類冠狀病毒NL63HUMANCONAVIRUSNL63，HCOVNL63以及2006年發(fā)現(xiàn)的人類冠狀病毒HKU1（HUMANCONAVIRUSHKU1，HCOVHKU1）之后發(fā)現(xiàn)的又一個人類冠狀病毒家族的新成員，這表明冠狀病毒對人類健康的威脅始終存在，然而到目前為止，在世界范圍內(nèi)還沒有切實有效的能用于臨床治療MERSCOV、SARSCOV等冠狀病毒感染的疫苗或特效藥物。冠狀病毒作為單股正鏈RNA病毒，編碼約16個非結(jié)構(gòu)蛋白NONSTRUCTURALPROTEINS，NSPS介導自身的轉(zhuǎn)錄復制過程。這其中，NSP5（即主蛋白酶）參與將冠狀病毒基因組編碼的復制酶多蛋白POLYPROTEINS，PPLA，PPLAB酶切水解為病毒基因組復制所必需的16個非結(jié)構(gòu)蛋白的過程，因而在冠狀病毒的轉(zhuǎn)錄復制中發(fā)揮了至關(guān)重要作用。并且在人體內(nèi)不存在NSP5的同源蛋白，因而NSP5蛋白是一個良好的抗冠狀病毒靶點。本論文首先運用分子置換法解析了MERSCOVNSP5與N3抑制劑復合物的227A晶體結(jié)構(gòu)，分析了NSP5與N3抑制劑間的精確相互作用，驗證了MERSCOVNSP5以同源二聚體的形式發(fā)揮活性功能，以CYSHIS二體構(gòu)成催化活性中心，為理解N3抑制MERSCOVNSP5的反應機理提供了良好的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)并且我們通過體外構(gòu)建的熒光酶活體系定量分析了N3分子對MERSCOVNSP5的抑制活性，從結(jié)構(gòu)和功能兩方面證實了N3確實是MERSCOVNSP5的良好抑制劑其次，我們比較并分析了冠狀病毒亞科不同成員MERSCOV、SARSCOV、HCOVHKU1和IBV的NSP5結(jié)合N3抑制劑的高度結(jié)構(gòu)保守性及輕微差異，期望為抗MERSCOV的抑制劑開發(fā)提供優(yōu)化指導。本論文的另外一部分工作為SARSCOVNSP13蛋白的蛋白質(zhì)晶體學研究。NSP13具有解旋酶及NTPASE酶功能，是冠狀病毒轉(zhuǎn)錄復制過程不可缺少的核心酶之一，也是一個良好的抗冠狀病毒藥物靶點。在本論文中，我們通過合理的分子克隆構(gòu)建及有效的蛋白表達純化手段，獲得了SARSCOVNSP13母體晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)29A，為最終解析SARSCOVNSP13的三維結(jié)構(gòu)奠定了良好的基礎(chǔ)。

簡介：日本腦炎JAPANESEENCEPHALITIS，JE，又稱流行性乙型腦炎，是由日本腦炎病毒JAPANESEENCEPHALITISVIRUS，JEV引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)人畜共患急性傳染病。其致死率高達30％左右，50％的患者會留下永久性的后遺癥，其中，中國的JE發(fā)病數(shù)占世界總發(fā)病數(shù)的80％以上。庫蚊伊蚊是該病的主要傳播媒介，而豬則是重要的傳染源和放大器。豬患JE的主要表現(xiàn)為懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔、公豬睪丸炎及少數(shù)仔豬呈神經(jīng)癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，用于JE免疫預防的疫苗有滅活疫苗和弱毒疫苗兩種，其安全性和較高的生產(chǎn)應用成本已成為人們?nèi)找骊P(guān)注的問題。近年來，病毒分子生物學和反向遺傳學的發(fā)展為開發(fā)新型JE疫苗提供了新的技術(shù)手段。本研究為進一步探索JEVWHE株基因組功能、致病機理及構(gòu)建高效新型疫苗，開展了以下工作1JEVWHE株全基因組特征分析本研究設(shè)計了11對特異性引物，采用RTPCR技術(shù)擴增得到覆蓋JEVWHE株基因組全長CDNA的11個特異性片段，測序分析表明，JEVWHE株基因組由一個開放閱讀框F，10296個核苷酸和5′端非編碼區(qū)5′UTR，95個核苷酸和3′端非編碼區(qū)3′UTR，585個核苷酸組成。核苷酸序列和氨基酸序列分析表明，WHE株與P3株親緣關(guān)系最近，但3′UTR形成的二級結(jié)構(gòu)與VELLEP20778株3′UTR形成的二級結(jié)構(gòu)最相似與黃病毒科其他屬成員比較，3′UTR最末端約84個核苷酸所形成的二級結(jié)構(gòu)相當保守。WHE株與P3株的膜蛋白E擁有M76、G306和L408三個特有氨基酸，而在其它19株JEV為T76、E306、S408，推測可能與病毒的宿主及組織嗜性有關(guān)。WHE株E蛋白中存在控制黃病毒毒力的RGD387389基序，而一部分弱毒株也有該基序，提示JVE毒力型的決定簇具有毒株特異性。由全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育圖與由E基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育圖僅有一些細微的差別，表明E基因在研究各分離株之間進化關(guān)系中具有重要意義；從GENBANK中調(diào)出不同時間和地區(qū)分離的140株JEVE基因，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育圖譜。2JEVWHE株全長CDNA的長鏈RTPCR法擴增采用長鏈RTPCR技術(shù)擴增基因組全長CDNA。對其進行PCR擴增鑒定，并對含復雜二級結(jié)構(gòu)的3′末端和5′末端非編碼區(qū)擴增片段進行了測序分析。擴增結(jié)果表明，擴增出的JEVWHE株基因組全長CDNA分子近11KB大?。环蔷幋a區(qū)測序分析表明，擴增產(chǎn)物為WAE株所特有。證明長鏈RTPCR法可用于JEVWHE株基因組全長CDNA的擴增。3JEVWHE株ONA疫苗載體構(gòu)建采用RTPCR技術(shù)擴增PRME和NS1全基因并進行序列分析，將其分別克隆于真核表達載體PAVX1，構(gòu)建的表達載體PAVX1PRME和PAVX1NS1，酶切鑒定和序列分析表明，JEVWHE株DNA疫苗載體構(gòu)建成功。4WHE株NS1基因在大腸桿菌中的表達將NS1基因克隆到PET28B表達載體，構(gòu)建了PET28BNS1重組表達載體，轉(zhuǎn)化表達宿主大腸桿菌BL21DE3，并對其進行了誘導表達，對表達產(chǎn)物進行檢測。結(jié)果表明，表達產(chǎn)物相對分子質(zhì)量約為43KU。為JE亞單位疫苗和DNA疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

簡介：詞匯是英語語言的重要組成部分，也是英語學習者水平高低的標志之一。短語動詞是英語詞匯的重要組成部分，被公認為英語學習的重點和難點之一，因為動詞和小品詞組合靈活，語義豐富，英語學習者不易掌握。以往對英語短語動詞的研究多從句法、語義或語義與句法相結(jié)合的角度進行，雖然取得一定研究成果，但為短語動詞教學和學習所提供的有效方法不多。自LAKOFF提出概念隱喻理論以來，國內(nèi)外很多學者開始從認知視角研究英語短語動詞學習，進行了各種相關(guān)理論研究和實證研究。但綜合分析前人研究，從認知理據(jù)視角對英語短語動詞進行分類研究、驗證認知教學法對何種類型的短語動詞有較好教學效果和學習收效的實證研究尚為數(shù)不多。本文以概念隱喻理論和意象圖式理論為理論框架，以認知理據(jù)為切入點，擬驗證和解答以下兩個研究問題第一，認知教學法能否促進大學生對短語動詞的學習第二，大學生學習何種類型的短語動詞學習效果更好，為什么本研究選取山東政法學院英語專業(yè)大學二年級2個自然班為受試，其中一班為實驗組，二班為控制組；兩個自然班的短語動詞初始水平基本相當。實驗組采用認知教學法學習短語動詞，控制組采用傳統(tǒng)教學法學習短語動詞。實驗教學所用短語動詞，均選自學生教材；擴展教學和測試所用短語動詞，均選自牛津短語動詞詞典。實驗為期12周，每周教學時間為45分鐘。該實證研究采用試卷測試的方式收集相關(guān)數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果表明首先，認知教學法能夠有效促進學生對短語動詞的學習。其次，通過認知教學法，學生對比喻型的短語動詞學習效果更好，對字面型和完成型短語動詞的學習效果也有明顯提升。本研究同時表明，以小品詞為中心，運用概念隱喻和意象圖式相結(jié)合的認知方式來闡釋短語動詞的認知理據(jù)，有助于學生理解和學習短語動詞的多重意義，有助于學生推測和理解短語動詞的比喻義和延伸義。該研究驗證了大學生學習概念隱喻和意象圖式理論的相關(guān)知識，有助于他們理解短語動詞的理據(jù)性，從而提高了短語動詞的學習效率，為英語短語動詞的學習提供了較為有效的方法。希望本研究能為英語短語動詞的教學和學習提供行之有效的參考、啟示和借鑒。

簡介：本課題的研究目標是對流感病毒血凝素轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域HA2進行截短和突變篩選獲得長度最短、轉(zhuǎn)位功能較強的HA2優(yōu)化短肽用于靶向促凋亡分子的構(gòu)建。在本課題組前期的工作中已將HA2引入到靶向促凋亡分子中體內(nèi)外實驗證實其具有轉(zhuǎn)位活性能夠促進殺傷效應分子從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)位到胞漿增強抗腫瘤作用。在此基礎(chǔ)上本研究對HA2進行改構(gòu)優(yōu)化設(shè)計獲得了6種截短體和3種突變體通過體外紅細胞溶解實驗、腫瘤細胞殺傷實驗和熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗FRET比較這些HA2截短體突變體的轉(zhuǎn)位功能強弱。首先我們利用體外紅細胞溶解實驗對HA2改構(gòu)體進行功能篩選如果破壞紅細胞膜的能力越強就會導致上清中血紅蛋白含量越高表明HA2改構(gòu)體的轉(zhuǎn)位功能越強。以野生型HA2作為對照將合成的上述9種HA2截短體突變體與分離的人外周血紅細胞相孵育。劑量效應實驗和時間效應實驗的結(jié)果均表明在相同條件下E5C3的溶血能力強于HA2E5弱于HA2并且呈現(xiàn)出時間依賴關(guān)系和某種程度的劑量依賴關(guān)系。羧基端的3個截短體C3、C15、C8中僅C3具有溶血能力提示HA2的2個螺旋區(qū)對于溶血功能至關(guān)重要去掉一個或兩個均會使HA2喪失溶血功能。氨基端的2個截短體N15和N3均喪失了溶血活性說明氨基端第一個氨基酸的重要性與文獻報道一致。而中間截短體M7、E5C3M7在增大劑量或延長時間時其溶血百分率均遠遠低于HA2表明中間氨基酸殘基可能對HA2的溶血功能有貢獻。通過體外紅細胞溶解實驗我們選出5個HA2截短體突變體進行下一步細胞內(nèi)的功能篩選其中HA2作為陽性對照E5C3的轉(zhuǎn)位功能明確、強于HA2C15、M7、E5C3M7的轉(zhuǎn)位功能微弱遠低于HA2。其次利用腫瘤細胞殺傷實驗對HA2改構(gòu)體進行功能篩選。將HA2截短體突變體引入本組前期構(gòu)建的其中一種靶向促凋亡分子中如果這些重組分子對腫瘤細胞的殺傷作用越強就表明HA2改構(gòu)體的轉(zhuǎn)位功能越強。本研究構(gòu)建了5種E23SFVFDTHA2截短體突變體TBID分別轉(zhuǎn)染兩種HER2陽性乳腺癌細胞BT474和SKBR3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果表明E5C3的轉(zhuǎn)位效率強于野生型HA2E5C3M7、C15、M7的轉(zhuǎn)位效率弱于HA2。最后利用FRET實驗對HA2改構(gòu)體進行功能篩選。將HA2截短體突變體插入EGFPFRET供體和MCHERRYFRET受體之間構(gòu)建HBSAG靶向的融合指示分子如果FRET信號丟失越多、MCHERRY彌散分布的程度越高就表明HA2改構(gòu)體的轉(zhuǎn)位功能越強。構(gòu)建了5種SCFV15EGFPFDTHA2截短體突變體MCHERRY穩(wěn)定轉(zhuǎn)染COS7細胞并建系預實驗顯示COS7細胞分泌表達的SCFV15EGFPFDTHA2MCHERRY可內(nèi)化進入乙肝表面抗原HBSAG陽性肝癌細胞PLCPRF5中并且呈內(nèi)吞體顆粒狀分布為進一步優(yōu)化FRET檢測窗口、分析MCHERRY亞細胞分布比率提供了初步的實驗依據(jù)。經(jīng)過上述實驗驗證HA2的突變截短體E5C3具有更強的轉(zhuǎn)位功能為下一步將其應用于靶向促凋亡分子奠定了基礎(chǔ)。

簡介：目的復制大鼠慢性間斷性缺氧CIH模型，通過觀察CIH過程中大鼠認知功能的變化、前額葉皮層和海馬神經(jīng)元組織學改變以及膽堿能系統(tǒng)的改變，探討CIH致大鼠認知障礙與相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元組織學及膽堿能系統(tǒng)改變的關(guān)系，為進一步闡明阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征OSAS導致認知功能障礙的機制提供實驗性依據(jù)。方法選取成年雄性SD大鼠體重約250±20G40只，隨機均分為4組對照組、慢性間斷性缺氧1周CIH1W組、慢性間斷性缺氧3周CIH3W組和慢性間斷性缺氧5周CIH5W組。各組大鼠均常規(guī)飼養(yǎng)。CIH各組大鼠每日放入自制的缺氧艙內(nèi)缺氧8小時，分別連續(xù)缺氧1周、3周和5周；應用MRIS水迷宮定位航行實驗和空間搜索實驗觀察對照組和CIH各組大鼠學習記憶功能的變化；利用HE染色在光學顯微鏡下對前額葉皮層和海馬組織學改變進行觀察；利用免疫組織化學方法顯示前額葉皮層和海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶CHAT和煙堿型乙酰膽堿受體Α4NACHRA4陽性細胞表達，應用IMAGEPROPLUS60分析系統(tǒng)進行定量分析，結(jié)果用光密度OD值表示。計量實驗數(shù)據(jù)用SPSS120統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果1MRIS水迷宮測試①定位航行實驗水下平臺各組大鼠逃避潛伏期隨實驗天數(shù)增加而逐漸縮短，不同天數(shù)間比較，逃避潛伏期有明顯差異P005；CIH5W組大鼠逃避潛伏期明顯延長，差異具有顯著性P005；CIH5W組大鼠在中環(huán)停留時間明顯減少，差異具有顯著性P005。2前額葉皮層和海馬神經(jīng)元組織學改變與對照組比較，CIH大鼠前額葉皮層和海馬變性壞死神經(jīng)元增多，并且隨著缺氧時間延長，上述改變呈逐漸加重趨勢。3CHAT在前額葉皮層和海馬的陽性表達結(jié)果CHAT陽性表達定位于胞漿中，呈棕黃色顆粒狀。各組均有CHAT陽性表達細胞。與對照組比較，CIH1W組前額葉皮層和海馬CHAT陽性表達減少，但差異無顯著性P005；CIH3W組和CIH5W組前額葉皮層和海馬CHAT陽性表達明顯減少，差異具有顯著性P005；CIH5W組前額葉皮層和海馬NACHRA4陽性表達明顯減少，差異具有顯著性P005。結(jié)論1慢性間斷性缺氧大鼠認知功能障礙隨缺氧時間延長呈逐漸加重趨勢，慢性間斷性缺氧達一定時間后大鼠出現(xiàn)明顯的認知功能障礙；2慢性間斷性缺氧致大鼠認知功能障礙的機制與大鼠前額葉皮層和海馬神經(jīng)元組織學改變有關(guān)；3慢性間斷性缺氧致大鼠認知功能障礙的機制與大鼠前額葉皮層和海馬膽堿能系統(tǒng)改變有關(guān)。

簡介：乙肝病毒全長基因組整合于轉(zhuǎn)基因小鼠品系＃59的第9號染色體內(nèi)。該轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)有乙肝病毒蛋白顯著表達但并不合成完整病毒顆粒。因此，＃59系轉(zhuǎn)基因小鼠在本研究中被用作動物模型，觀察乙肝病毒蛋白影響下，宿主肝、腎組織的基因表達譜改變。AFFYMERTRIX小鼠430A芯片實驗數(shù)據(jù)表明，與乙肝病毒蛋白陰性對照小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織顯著上調(diào)表達基因520個，顯著下調(diào)表達基因76個。差異表達基因功能歸類分析顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠腎組織中補體激活、凝血與急性期反應相關(guān)生理通路被強烈激活。斑點免疫檢測亦在蛋白水平證實了補體C3成分在腎組織中的上升。＃59系轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)并無乙肝病毒蛋白抗原一抗體復合物檢出。因此，上述實驗觀察從動物模型的角度支持了局部、長期的病毒蛋白表達在乙肝相關(guān)性腎病病因?qū)W中起重要作用的假說?；蛐酒瑢嶒灲Y(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中顯著上調(diào)表達基因43個，顯著下調(diào)表達基因104個。其中多個與細胞生長、凋亡相關(guān)基因如JUN、FOS、IGFBPL、IGFBP5、LJSP2等的表達發(fā)生顯著改變，表明肝組織細胞生長與凋亡狀態(tài)受到乙肝病毒蛋白的顯著影響。但是，以上細胞凋亡調(diào)控通路改變的趨勢并不一致，故此，肝細胞在乙肝病毒蛋白作用下的凋亡水平變化尚有待進一步研究。轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織基因表譜達改變還提示肝組織細胞中肌動蛋白聚合水平下降，網(wǎng)絡化水平上升，導致潛在移行能力下降。同時，某些細胞間質(zhì)相關(guān)基因的表達改變也提示細胞的潛在移行能力與侵犯能力下降。這一觀察與文獻報道中HBX的生理效能似成拮抗。其生物學意義有待進一步觀察與證實。