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簡(jiǎn)介：乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致的乙型肝炎是世界性傳染病同時(shí)也是中國(guó)最嚴(yán)重的傳染病在中國(guó)具有30年以上的傳染史。其高發(fā)的耐藥性以及誘發(fā)肝硬化肝癌導(dǎo)致了嚴(yán)重的中國(guó)醫(yī)療問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。HBV基因組HBVDNA由不閉合的雙鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)DNA組成含約3200個(gè)核苷酸主要分為P、C、X、S四個(gè)區(qū)。HBVDNA具有高度突變性并由此形成了HBVDNA不同的基因型。耐藥的產(chǎn)生和肝硬化肝癌的發(fā)展與乙肝病毒基因型和基因突變直接相關(guān)。本課題觀(guān)察了西北地區(qū)較大樣本量的乙肝患者HBV基因突變的情況發(fā)現(xiàn)了系列新的HBV遺傳特性以及新的病程標(biāo)志性位點(diǎn)詳細(xì)分析了基因型、基因突變與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性為最終建立乙肝病毒感染相關(guān)性疾病的個(gè)體化診斷奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)一乙型肝炎病毒基因生物信息學(xué)分析及引物設(shè)計(jì)通過(guò)使用生物信息學(xué)分析方法針對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中包含AH8個(gè)基因型的49例HBV基因組全序列進(jìn)行BLAST分析比較獲得了HBVPS基因區(qū)可覆蓋8個(gè)型的分型基因片段、P基因突變熱點(diǎn)區(qū)擴(kuò)增片段、BCPPRECC基因區(qū)突變熱點(diǎn)擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)了相應(yīng)區(qū)域PCR擴(kuò)增引物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了各目標(biāo)區(qū)域PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序的可行性建立并優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)二HBVP基因區(qū)突變分析與核苷類(lèi)藥物治療耐藥相關(guān)性研究使用生物信息學(xué)分析以及SANGER測(cè)序法針對(duì)HBV未用藥者、核苷類(lèi)藥物治療發(fā)生臨床耐藥的慢性乙肝患者血液標(biāo)本以及肝硬化肝癌患者組織樣本進(jìn)行了所感染的HBVP基因區(qū)測(cè)序分析對(duì)DNA測(cè)序結(jié)果應(yīng)用自主研發(fā)軟件HBVLINER、HBVDRUGGUIDE和NCBIGENOTYPINGTOOL軟件的對(duì)比分析證實(shí)了HBVLINER軟件能夠有效判斷基因型HBVDRUGGUIDE軟件能夠準(zhǔn)確分析基因變異數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示中國(guó)西北地區(qū)HBV感染者的基因型分布以C基因型為主5931％B基因型其次3835D基因型較少234未見(jiàn)A基因型P區(qū)基因在核苷類(lèi)藥物的壓力下出現(xiàn)RT1694340、RT1804717、RT181189、RT202567、RT2043208、RT236377、RT250189突變其中RT169突變與恩替卡韋相關(guān)RT180突變與拉米夫定、恩替卡韋和替比夫定相關(guān)RT204突變與拉米夫定和替比夫定相關(guān)發(fā)現(xiàn)了B基因型存在RT169和RT180的天然突變突變比例在未用藥組、耐藥組和肝硬化肝癌組達(dá)到平均99以上RTI169同義突變與RTL180F錯(cuò)義突變的產(chǎn)生可能與長(zhǎng)期藥物壓力下進(jìn)化相關(guān)該2個(gè)突變具有潛在遺傳變異性說(shuō)明我國(guó)乙肝存在遺傳漂變可能性。實(shí)驗(yàn)三HBVBCPPRECC基因區(qū)突變分析與肝硬化肝癌的臨床相關(guān)性研究使用生物信息學(xué)分析以及SANGER測(cè)序法針對(duì)HBV未用藥者的外周血標(biāo)本、肝硬化肝癌患者的手術(shù)切除病理標(biāo)本進(jìn)行了所感染的HBVBCPPRECC基因區(qū)突變與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性分析對(duì)DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了自主研發(fā)軟件HBVDRUGGUIDE的對(duì)比分析證實(shí)了HBVDRUGGUIDE軟件對(duì)該區(qū)域突變分析的可行性和優(yōu)勢(shì)性發(fā)現(xiàn)該區(qū)域基因在未用藥組和肝硬化肝癌組臨床標(biāo)本中具有17621764位置的多發(fā)突變突變比例平均50以上以ALT、AST數(shù)值40UL為界限關(guān)聯(lián)性對(duì)比其他位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)17621764的突變與未突變樣本間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P00517621764突變與肝損傷呈正相關(guān)18961899突變?cè)谖从盟幗M中以HBEAG1為界限關(guān)聯(lián)性對(duì)比17621764等其他位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)18961899的突變與未突變樣本間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P00001。18961899突變與HBEAG呈負(fù)相關(guān)首次發(fā)現(xiàn)了HBVB基因型感染者存在G1799C新突變?cè)诟斡不伟┙M的B基因型樣本中發(fā)現(xiàn)G1799C突變與未突變比例具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P00001G1799C與肝硬化肝癌呈正相關(guān)性由于其與X蛋白變異相關(guān)說(shuō)明該位點(diǎn)可作為乙肝病毒導(dǎo)致肝硬化肝癌的標(biāo)志性位點(diǎn)。

簡(jiǎn)介：目的比較回、漢族老年患者麻醉手術(shù)后早期認(rèn)知功能障礙的發(fā)病率，探討兩民族老年患者早期POCD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。方法擇期手術(shù)回、漢族老年患者300例，年齡≥60歲，性別不限，ASA分級(jí)Ⅰ～Ⅲ級(jí)。依據(jù)民族不同分為漢族組和回族組。兩組患者分別于手術(shù)前1D，術(shù)后1D、3D7D記錄MMSE的評(píng)分結(jié)果。根據(jù)300例老年患者是否發(fā)生POCD可分為POCD組和非POCD組，對(duì)回、漢族老年患者早期POCD發(fā)病率進(jìn)行比較。分別記錄兩組患者的年齡、性別、身高、體重、文化程度、術(shù)前MMSE評(píng)分、術(shù)前合并癥、麻醉方式、麻醉時(shí)間、手術(shù)類(lèi)型、術(shù)后并發(fā)癥、術(shù)后ICU治療圍術(shù)期相關(guān)因素。結(jié)果300例患者中，107例發(fā)生POCD，發(fā)病率為357％；回族患者148例，其中63例發(fā)生POCD，發(fā)病率為426；漢族患者152例，其中44例發(fā)生POCD，發(fā)病率289。多因素LOGISTIC回歸分析表明，糖尿病5282、高血壓4130、高血脂3419、術(shù)后呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥（6333）是回族患者麻醉手術(shù)后早期POCD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素P結(jié)論本研究結(jié)果表明回族老年患者麻醉手術(shù)后早期POCD發(fā)病率較漢族高，高血壓、糖尿病、高血脂及術(shù)后呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥是回族老年患者麻醉手術(shù)后早期發(fā)生POCD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；高齡、文盲、高血壓及糖尿病是漢族老年患者麻醉手術(shù)后早期POCD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

簡(jiǎn)介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文乙型肝炎病毒基因型對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)性狀及行為影響研究姓名訾力申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)外科學(xué)指導(dǎo)教師陳濤20100520材料和方法1病例選擇本實(shí)驗(yàn)選擇我院99例伴HBV感染的HCC患者為研究對(duì)象。入院時(shí)常規(guī)進(jìn)行肝功能、病毒血清標(biāo)志物、HBVDNA定量、腫瘤標(biāo)志物、B超、CT／MR等檢查，根據(jù)檢查結(jié)果及術(shù)后病理結(jié)果，排除其他肝炎病毒感染及其他肝臟疾病。2標(biāo)本收集和制作所有病例術(shù)前抽取56ML患者靜脈血，離心，取上層血清，于80℃冰箱凍存；相應(yīng)患者腫瘤組織標(biāo)本收集并行HE染色、網(wǎng)織纖維染色。3乙型肝炎病毒基因型檢N采用巢式PCR方法擴(kuò)增HBV基因的S區(qū)，而后對(duì)特異性產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果輸入MEGA基因分析軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。4病理學(xué)檢查包括大體標(biāo)本檢查和HE染色、網(wǎng)織纖維染色玻片鏡檢，由兩位病理醫(yī)生獨(dú)立觀(guān)察，內(nèi)容包括腫瘤最大徑、腫瘤數(shù)目單發(fā)還是多發(fā)、衛(wèi)星子灶形成、血管侵犯和癌栓、包膜形成、腫瘤組織分化、周?chē)谓M織纖維化分期。5術(shù)后隨訪(fǎng)所有入選病例根治性手術(shù)后，每2～3周復(fù)查一次，常規(guī)檢測(cè)AFP和腹部B超，懷疑復(fù)發(fā)者行B超造影、CT／MR檢查。統(tǒng)計(jì)患者的疾病進(jìn)展時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間。6使用SPSS110統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)計(jì)量資料采用F檢驗(yàn)、T檢驗(yàn)或單因素方差分析法分析；偏態(tài)分布資料采用WILCOXON或KWALLIS秩和檢驗(yàn)分析；定性資料采用卡方檢驗(yàn)或FISHER精確概率法分析；疾病進(jìn)腱時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間用LOGRANK生存分析。以上檢驗(yàn)均以P005認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鈷田皇口爿R99例患者中，共檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果87例，其中B2型組37例425％，C型組50例575％。男性77例885％，女性10例115％，平均年齡為51191139歲。兩組性別、年齡均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，B2型組患者在40歲以下年齡段及50歲以下年齡段所占比例相對(duì)較大。N

簡(jiǎn)介：本研究分三個(gè)部分一、體外培養(yǎng)人外周血白細(xì)胞中阿德福韋酯誘生干擾素的作用研究；二、阿德福韋酯對(duì)慢性乙型肝炎患者血清IFNΓ和IL4水平的影響；三、阿德福韋酯和拉米夫定對(duì)慢性乙型肝炎患者血清IFNΓ和IL4水平的對(duì)照研究。一、體外培養(yǎng)人外周血白細(xì)胞中阿德福韋酯誘生干擾素的作用研究目的觀(guān)察阿德福韋酯對(duì)慢性乙型肝炎CHB患者和健康人體外培養(yǎng)的外周血白細(xì)胞WBC作用后，培養(yǎng)上清中干擾素活性的動(dòng)態(tài)變化，探討阿德福韋酯是否能誘導(dǎo)WBC產(chǎn)生干擾素。方法抽取20名CHB患者和20名健康人的外周血，將白細(xì)胞放入有不同濃度阿德福韋酯5ΜGML、75ΜGML、10ΜGML及無(wú)藥對(duì)照組的培養(yǎng)液中，分別于24、48及72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)利用微量細(xì)胞病變抑制法CPE測(cè)定培養(yǎng)液中IFN的效價(jià)。結(jié)果健康人組中，24小時(shí)點(diǎn)三組均高于無(wú)藥對(duì)照組P＜0001，其中5ΜGML組72小時(shí)點(diǎn)與24小時(shí)點(diǎn)比有明顯升高P＜0001；CHB病人組中，各時(shí)間點(diǎn)不同濃度阿德福韋酯組與對(duì)照組無(wú)差異；結(jié)論阿德福韋酯有一定誘生正常人WBC分泌干擾素的作用，而對(duì)慢性乙肝患者的WBC則此作用不明顯。二、阿德福韋酯對(duì)慢性乙型肝炎患者血清IFNΓ和IL4水平的影響目的觀(guān)察阿德福韋酯治療前后慢性乙型肝炎患者外周血清IFNΓ和IL4水平的變化，探討阿德福韋酯抗乙肝病毒免疫效應(yīng)的機(jī)制。方法108例CHB均為參加隨機(jī)、雙盲、對(duì)照、多中心阿德福韋酯Ⅲ期臨床試驗(yàn)中服用阿德福韋酯的患者，用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)治療前，治療后4、12、24及48周末患者血清中IFNΓ和IL4的水平，同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)PCR檢測(cè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的血清HBVDNA。結(jié)果CHB患者ALT和AST在治療12周后明顯下降，到24周末達(dá)到正常范圍，并持續(xù)到治療結(jié)束；HBVDNA在4周末明顯低于治療前P＜005，并持續(xù)下降至治療結(jié)束IFNΓ和IL4水平逐漸上升，在24周末及48周末與治療前相比有顯著差異P＜0001。結(jié)論阿德福韋酯抗病毒治療后使機(jī)體免疫部分恢復(fù)或增強(qiáng)，這種作用可能是隨著由于治療引起的病毒負(fù)載下降和CD4T淋巴細(xì)胞活性的重建而出現(xiàn)的。三、阿德福韋酯和拉米夫定對(duì)慢性乙型肝炎患者IFNΓ和IL4的對(duì)照研究目的觀(guān)察阿德福韋酯和拉米夫定治療前后慢性乙型肝炎CHB患者外周血清IFNΓ和IL4的變化，對(duì)照觀(guān)察兩種核苷類(lèi)似藥物抗乙肝病毒的免疫效應(yīng)。方法214例CHB均為參加阿德福韋酯Ⅲ期臨床試驗(yàn)的患者，用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)PCR檢測(cè)治療前、治療后4、12、24及48周末患者血清HBVDNA，其中40例患者利用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的血清中IFNΓ和IL4的水平。結(jié)果慢性乙肝病人ALT和AST治療后兩組間改善值基本相同；HBVDNA改善值拉米夫定LVD組從4周末起明顯高于阿德福韋酯ADV組P＜005，在48周末兩組改善值基本相同；LVD組IFNΓ水平在12周末達(dá)到高峰，而ADV組在48周末IFNΓ水平才明顯上升，LVD組IFNΓ在4周末明顯高于ADV組P＜005；ADV組IL4在48周末與LVD組比有明顯差異P＜005。結(jié)論兩種核苷類(lèi)似藥物抗病毒后均能使機(jī)體免疫部分恢復(fù)或增強(qiáng)，這種作用可能都是隨著治療后病毒負(fù)載下降和CD4T淋巴細(xì)胞活性的重建而出現(xiàn)的。

簡(jiǎn)介：背景及目的腦白質(zhì)病變WHITEMATTERLESIONSWML是一種以中樞神經(jīng)細(xì)胞的髓鞘受損為主要特征的大腦結(jié)構(gòu)性改變主要累及分布在側(cè)腦室周?chē)鞍肼褕A區(qū)發(fā)揮高級(jí)大腦功能的白質(zhì)束。腦白質(zhì)病變可以分為腦室旁白質(zhì)病變和深部白質(zhì)病變兩種類(lèi)型它們的病理機(jī)制和危險(xiǎn)因素可能不同但目前多數(shù)研究支持慢性缺血性損傷的假說(shuō)普遍認(rèn)為腦白質(zhì)病變是由腦小血管硬化引起白質(zhì)慢性缺血從而導(dǎo)致髓鞘脫失和膠質(zhì)增生引起的。隨著MRIMAGICRESONANCEIMAGING的廣泛應(yīng)用超過(guò)一半的老年人MRI檢查可見(jiàn)到不同程度的腦白質(zhì)病變而且隨著年齡的增大腦白質(zhì)病變的患病率也隨之升高。過(guò)去認(rèn)為腦白質(zhì)病變是一種正常的生理過(guò)程但是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已有大量研究表明大腦半球白質(zhì)變性是癡呆的重要危險(xiǎn)因素甚至可能是引起認(rèn)知功能減退的直接因素。認(rèn)知功能障礙是大腦在高級(jí)智能的加工過(guò)程中發(fā)生異常改變引起學(xué)習(xí)障礙及記憶障礙伴有失認(rèn)、失語(yǔ)、失行或失用等變化的病理過(guò)程。大腦皮層功能正常是認(rèn)知的前提一切導(dǎo)致大腦皮層結(jié)構(gòu)及功能異常改變的因素均可引起認(rèn)知功能受損。研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加認(rèn)知功能減退的發(fā)病率及患病率也顯著增加。隨著我國(guó)人口老齡化現(xiàn)象逐漸加重認(rèn)知功能受損日益威脅老年人群的健康。盡管已經(jīng)有研究報(bào)道不同部位的腦白質(zhì)病變與特定方面認(rèn)知損害有關(guān)但腦白質(zhì)病變導(dǎo)致認(rèn)知損害的病理機(jī)制仍未得到澄清有必要展開(kāi)進(jìn)一步研究。因此本研究的目的即探討側(cè)腦室旁白質(zhì)變性患者認(rèn)知損害特征及其與特定白質(zhì)纖維束損傷的關(guān)系促進(jìn)對(duì)白質(zhì)病變導(dǎo)致認(rèn)知損害的病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)。方法本研究選擇單純側(cè)腦室旁白質(zhì)變性患者作為研究對(duì)象。采用成套神經(jīng)心理量表和單項(xiàng)認(rèn)知量表評(píng)價(jià)研究對(duì)象認(rèn)知損害特征采用磁共振彌散張量成像技術(shù)評(píng)價(jià)研究對(duì)象大腦白質(zhì)纖維束損傷采用基于磁共振圖像的皮層厚度測(cè)量來(lái)評(píng)估大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)改變采用單因素分析來(lái)探討與認(rèn)知功能受損可能相關(guān)的因素采用多因素相關(guān)分析來(lái)探討腦白質(zhì)纖維束損傷、與之聯(lián)系的皮質(zhì)結(jié)構(gòu)改變及特定方面認(rèn)知損害間的關(guān)系。結(jié)果與正常對(duì)照組相比在認(rèn)知損害方面單純側(cè)腦室旁腦白質(zhì)病變患者同時(shí)存在多個(gè)領(lǐng)域的認(rèn)知功能受損以執(zhí)行功能和語(yǔ)言流暢性受損較為突出視空間結(jié)構(gòu)能力、記憶力、注意力受累但相對(duì)較輕在腦白質(zhì)纖維束受損方面單純側(cè)腦室旁白質(zhì)病變患者側(cè)腦室旁前角、后角白質(zhì)及胼胝體膝部的FAFRACTIONALANISOTROPY值顯著降低在皮質(zhì)結(jié)構(gòu)改變方面單純側(cè)腦室旁白質(zhì)病變患者額極、額葉眶回、額上回、額中回、腦島、楔葉等大腦皮層厚度顯著變薄。單因素分析提示年齡與執(zhí)行功能之間呈負(fù)相關(guān)受教育程度與語(yǔ)言流暢性及數(shù)字廣度呈正相關(guān)女性患者的語(yǔ)言流暢性及數(shù)字廣度評(píng)分較男性顯著偏低高血壓患者的語(yǔ)言流暢性評(píng)分較血壓正?；颊唢@著偏低吸煙患者的聽(tīng)覺(jué)詞語(yǔ)學(xué)習(xí)測(cè)驗(yàn)評(píng)分較未吸煙患者顯著偏低左側(cè)大腦半球側(cè)腦室前角、后角右側(cè)大腦半球側(cè)腦室前角、后角區(qū)FA值與TMTBATRAILMAKINGTESTBA時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)左、右側(cè)大腦半球側(cè)腦室后角及胼胝體膝部區(qū)FA值與VFTVERBALFLUENCYTEST評(píng)分呈顯著正相關(guān)側(cè)腦室旁腦白質(zhì)病變患者雙側(cè)額極、額上回、額中回、眶額回、顳上回、顳中回、島回、舌回、楔葉等腦區(qū)的皮層厚度與TMTBA時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)側(cè)腦室旁腦白質(zhì)病變患者雙側(cè)額中回、顳上回、顳中回、舌回、楔葉及右側(cè)眶額回等腦區(qū)的皮層厚度與VFT評(píng)分呈顯著正相關(guān)側(cè)腦室旁腦白質(zhì)病變患者右側(cè)額中回、顳上回等腦區(qū)的皮層厚度與DSTDIGITSPANTEST評(píng)分之間呈顯著正相關(guān)側(cè)腦室旁腦白質(zhì)病變患者雙側(cè)額中回、顳上回、顳中回、島回等腦區(qū)的皮層厚度與AVLTHAUDITYVERBALLEARNINGTEST評(píng)分之間呈顯著正相關(guān)。排除年齡、性別、高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙及受教育程度等影響因素后多因素相關(guān)分析提示在加入大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)改變這一因素后側(cè)腦室旁白質(zhì)變性患者腦白質(zhì)纖維束損傷不再與認(rèn)知功能損害之間存在相關(guān)關(guān)系大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)改變與認(rèn)知功能障礙之間存在獨(dú)立相關(guān)關(guān)系。雙側(cè)額極、額上回、額中回、眶額回、顳上回、顳中回、島回、舌回、楔葉等腦區(qū)的皮層結(jié)構(gòu)改變可引起執(zhí)行功能受損。雙側(cè)額中回、顳上回、顳中回、舌回、楔葉及右側(cè)眶額回等腦區(qū)的皮層結(jié)構(gòu)改變可引起語(yǔ)言流暢性受損。結(jié)論單純側(cè)腦室旁腦白質(zhì)病變患者同時(shí)存在多個(gè)領(lǐng)域的認(rèn)知功能受損以執(zhí)行功能和語(yǔ)言流暢性受損較為突出側(cè)腦室旁白質(zhì)變性患者大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)改變介導(dǎo)腦白質(zhì)纖維束損傷與認(rèn)知功能損害之間的相關(guān)關(guān)系。

簡(jiǎn)介：本研究將40只大鼠隨機(jī)分為四組A組正常對(duì)照組；B組LPS損傷組；C組腺病毒轉(zhuǎn)載IΚB治療組；D組腺病毒轉(zhuǎn)載LAZ基因轉(zhuǎn)染評(píng)價(jià)組。每組10只。A、B組經(jīng)中心靜脈注入生理鹽水1MLC組注入滴度為1109空斑形成單位PFU的腺病毒轉(zhuǎn)載的IΚB基因1MLD組注入滴度為1109空斑形成單位PFU的腺病毒轉(zhuǎn)載的LAZ基因1ML四組均以恒速緩慢30分鐘注射完畢，A、D組經(jīng)尾靜脈注入生理鹽水1MLB、C組經(jīng)尾靜脈注入脂多糖LPS5MGKG容積1ML復(fù)制感染性ALI模型。觀(guān)察7天后的大鼠動(dòng)脈血?dú)夥治?、肺濕干重比WD、IKB基因轉(zhuǎn)染率、血漿中TNFΑ、IL6的含量、肺組織中NFΚBP65蛋白的表達(dá)及光鏡下肺組織病理改變及肺損傷評(píng)分。研究結(jié)論；經(jīng)中心靜脈途徑注入腺病毒轉(zhuǎn)載的IΚB基因，可在肺內(nèi)高效表達(dá)，可用于呼吸系統(tǒng)疾病的基因治療，可降低急性肺損傷大鼠血液中炎性因子TNFΑ、IL6的含量，抑制NFΚB的活化核轉(zhuǎn)移，減少肺水含量，減少肺泡塌陷及肺實(shí)變，減輕經(jīng)尾靜脈注入LPS造成的急性肺損傷。

簡(jiǎn)介：目的1試圖通過(guò)研究肝氣郁結(jié)型MCI患者的影像學(xué)特征，探索MCI療效評(píng)價(jià)的客觀(guān)指標(biāo)。2通過(guò)考察疏肝解郁藥物對(duì)肝氣郁結(jié)型MCI患者認(rèn)知情況的改善，探討其療效機(jī)制。方法1應(yīng)用臨床流行病學(xué)現(xiàn)況調(diào)查法，對(duì)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢中心、河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院體檢中心及鄭州市大型社區(qū)所招募的志愿者，對(duì)4665歲的中老年人進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，運(yùn)用2004年國(guó)際MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)篩選MCI患者，用徐志偉等制定的肝氣郁結(jié)證癥狀篩選標(biāo)準(zhǔn)（2006年）篩選肝氣郁結(jié)型MCI患者。2以肝氣郁結(jié)型MCI患者為被試，采用GE30T磁共振系統(tǒng)采集被試磁共振波譜（MRS），比較用藥前后MCI患者M(jìn)RS之間的差異。3以肝氣郁結(jié)型MCI患者為被試，于用藥前后分別采集血液標(biāo)本及尿樣，運(yùn)用酶聯(lián)免疫分析法分析尿8羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8OHDG）、過(guò)氧化脂質(zhì)（LPO）和超氧化物歧化酶（SOD）。結(jié)果1肝氣郁結(jié)型MCI患者用藥后的8OHDG較用藥前降低（P＜005）；用藥后的SOD及LPO值較用藥前均無(wú)明顯變化（P＞005）。2在右側(cè)海馬區(qū)肝氣郁結(jié)型MCI患者用藥后代謝物NAAMI較用藥前降低（P＜005）；其他腦區(qū)相關(guān)代謝物水平與用藥前相比，無(wú)明顯差異（P＞005）。3肝氣郁結(jié)型MCI患者M(jìn)OCA量表用藥前后各項(xiàng)得分比較，視空間與執(zhí)行、注意、語(yǔ)言、抽象、延遲回憶、定向能力及總分均結(jié)果高于用藥前（P＜005）；命名得分與用藥前相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞005）。結(jié)論疏肝法能夠改善肝郁MCI患者的認(rèn)知功能。降低氧化水平，提高神經(jīng)元修復(fù)能力是其可能的原因之一。

簡(jiǎn)介：目的探討EB病毒相關(guān)性重癥傳染性單核細(xì)胞增多癥SEVEREINFECTIOUSMONONUCLEOSIS，簡(jiǎn)稱(chēng)重癥IM和EB病毒相關(guān)性嗜血淋巴組織細(xì)胞增生癥EPSTEINBARRVIRUSASSOCIATEDHEMOPHAGOCYTICLYMPHOHISTIOCYTOSIS，EBVHLH的臨床特點(diǎn)、診斷標(biāo)準(zhǔn)、治療及療效，并分析預(yù)測(cè)EBVHLH發(fā)生的危險(xiǎn)因素，為防治EBVHLH提供臨床依據(jù)。方法回顧性分析41例重癥IM和EBVHLH的住院病歷資料，總結(jié)其主要臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果、診斷、治療及短期療效，并探討預(yù)測(cè)EBVHLH發(fā)生的危險(xiǎn)因素。結(jié)果1本組41例中，男女比例為241；1～6歲占707％；夏秋季發(fā)病者占683％；城鄉(xiāng)比例為14141例均無(wú)陽(yáng)性家族史。2主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱100％、肝脾腫大902％、咽峽炎878％、頸淋巴結(jié)腫大537％。EBVHLH組熱程明顯長(zhǎng)于重癥IM組P0008，最高體溫亦明顯高于重癥IM組P0001；而咽峽炎、肝脾淋巴結(jié)大小無(wú)顯著性差異P005。3EBVHLH組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)WBC、中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)ANC、血紅蛋白HB、血小板計(jì)數(shù)PLT、白蛋白ALB明顯低于重癥IM組，總膽紅素TB、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST和乳酸脫氫酶LDH明顯高于重癥IM組，有顯著性差異P005。EBVHLH組臟器損害數(shù)明顯多于重癥IM組P0006。4EBVHLH組中100％1212例鐵蛋白SF增高；941％1617例纖維蛋白原FG降低；882％1517例甘油三酯TG增高。5EBVDNAPCR、血清EBV抗體、傳單快速診斷試驗(yàn)和嗜異凝集試驗(yàn)陽(yáng)性率分別為880％、854％、545％和45％，EBVHLH組中18例EBVDNAPCR均為陽(yáng)性，其中有3例血清EBV抗體陰性。6EBVHLH組骨髓有核細(xì)胞以增生減低為主1217例，重癥IM組則以增生活躍為主1214例，兩組間有顯著性差異P0005。兩組骨髓細(xì)胞學(xué)檢查組織細(xì)胞比例均有增高，最高達(dá)355％。15例EBVHLH患兒骨髓中發(fā)現(xiàn)吞噬血細(xì)胞的組織細(xì)胞。7EBVHLH組中9例ED免疫化療6例顯效療程≥1周，3例無(wú)效2例療程1周；8例抗病毒和或激素治療，2例顯效療程≥1周，6例無(wú)效4例療程1周。重癥IM組均用抗病毒和或激素等治療，13例顯效11例療程≥1周，7例無(wú)效5例療程1周。結(jié)論1重癥IM和EBVHLH均以男性多見(jiàn)，1～6歲為高發(fā)年齡段，夏秋季發(fā)病者較多。發(fā)熱、咽峽炎、肝脾淋巴結(jié)腫大是常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)。熱程、最高體溫有助于判斷是否會(huì)發(fā)生EBVHLH。2重癥IM和EBVHLH均有不同程度的血液系統(tǒng)和肝臟損害。發(fā)生EBVHLH時(shí)血液系統(tǒng)和肝臟損害更重，并且多臟器損害更多見(jiàn)。SF、TG、FG是EBVHLH的特異性指標(biāo)，故一旦懷疑EBVHLH，應(yīng)盡早完善這三項(xiàng)檢查，便于早期診斷治療。3EBVDNAPCR和血清EBV抗體的敏感性明顯高于傳單快速診斷試驗(yàn)和嗜異凝集試驗(yàn)。在EBVHLH中EBVDNAPCR比血清EBV抗體敏感性更高，故血清EBV抗體陰性時(shí)不能除外EBV感染，需查EBVDNAPCR以明確。4絕大多數(shù)EBVHLH患兒骨髓細(xì)胞學(xué)檢查可見(jiàn)骨髓有核細(xì)胞增生減低，組織細(xì)胞比例增高，特征性改變?yōu)槭裳F(xiàn)象，這是EBVHLH診斷和鑒別診斷的重要依據(jù)。骨髓增生減低是預(yù)測(cè)EBVHLH發(fā)生的顯著危險(xiǎn)因素，一旦發(fā)現(xiàn)增生減低，應(yīng)積極尋找EBVHLH的證據(jù)，爭(zhēng)取早期診治。5EBVHLH用ED免疫化療多可在短期內(nèi)取得較好療效，體溫和PLT可作為判斷其短期療效的指標(biāo)。重癥IM用抗病毒治療多數(shù)顯效，如治療無(wú)效需警惕發(fā)生EBVHLH的可能。我們認(rèn)為一旦確診EBVHLH，應(yīng)及早使用ED免疫化療。足夠的療程對(duì)于EBV相關(guān)性重癥IM和EBVHLH的治療非常重要。

簡(jiǎn)介：華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的反義血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制角膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究姓名周煉紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)眼科指導(dǎo)教師胡燕華20040501華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文剪接方式來(lái)自同一基因，VEGFL2L和VEGFL65怒可溶性蛋囪，其中VEGFL65是最主娶麴巽梅奉，天然懿VEGF鼯表理出VEGFM的主要特性。VEGF是一種商液特異性的盛管內(nèi)皮細(xì)胞肖絲分裂素，與其受體結(jié)含后，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的作用，從而加速新生血管的形成，VEGF在體內(nèi)，還縣有增宓鑫管逶透性戇修，孽L。因此，在缺氧、炎痰及外強(qiáng)等媾況下，VEGF霹促進(jìn)出斑、漏血和不成熟的新生血管形成。由于VEGFL65在皿管生成的生理和病理過(guò)程中起中心調(diào)控作用，我們?cè)噲D逶過(guò)隰叛VEGF㈦粒L乍弼，鼓露季【|L利病理狀況下角膜瑟壘纛管的形殘。爨1990年美國(guó)的一名腺苷脫氨酶歌乏癥患者接受基因治療并獲得成功后，艇因治療已取得很大的J敷展。所謂基因治療是指通J過(guò)在特定靶細(xì)胞中表達(dá)該細(xì)胞本來(lái)不表達(dá)懿基因，袋采蔫特定方式關(guān)凌、李露鍵舅鬻表達(dá)懿鏊因，達(dá)翼浚療疾病的目的。限作為基因治療的靶器官，具有與生俱來(lái)的優(yōu)越性，眼球閡其屈光問(wèn)質(zhì)透明，位鍶表淺易于接J慝，可進(jìn)行精確的定位轉(zhuǎn)染，亦有利于纂因轉(zhuǎn)移遭壤夔褒寨。勞燕羲痔是免痰教受區(qū)，爨蠢戇臻懿免疫舉特性，鴦潮予目的基因的轉(zhuǎn)染及襲達(dá)。目前跟瘸的基因治療研究方興未I，基因治療所需的關(guān)鍵技術(shù)，便是能將外源的目的基本轉(zhuǎn)移到人體，并能有效地適度表達(dá)，困魏載臻技本在基鬻治療中占鴦一分重要戇逡經(jīng)。理想戇魏髂應(yīng)該是能將霾的基因辱入相應(yīng)靶器官，并安全、有效和長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)。本研究利用重組腺相關(guān)病毒RAAV作為基因治療的裁體，使用反義RNA羧零，疆顴毅黛鑫譬彩或避稷中VEGF豹L車(chē)瘸，簌毳蟄蘩L純學(xué)澆痿蕊霜膜新生施管的形成。熬個(gè)研究分為三部分。第～部分，高滴度重組腺相關(guān)病毒的包裝、純化及滴發(fā)測(cè)定。本研究所采弱豹RAAV是一耱凝型夔，專(zhuān)廣泛痤?lèi)?ài)茲豢豹萋囂浚療懿簸缽，莢密主范圍廣，使用安全，無(wú)致病性和免痰源性，其最大的特點(diǎn)是可熬臺(tái)到人類(lèi)第19號(hào)染色體上，長(zhǎng)期淡達(dá)。但是存在包裝效率低的缺點(diǎn)，XIAOX等改進(jìn)了包裝方法，整瘸三蒺越裝轉(zhuǎn)染法，大大撬裹了憊裝效率，城少了程裝蓬翟中爨褒

簡(jiǎn)介：研究背景阿爾茨海默病AD，也稱(chēng)老年性癡呆，是一種以進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶能力減退和認(rèn)知功能障礙為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，伴有不同程度的運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言和人格等多方面的異常。目前，我國(guó)正步入老齡化社會(huì)，老年人口不斷增多，AD患者越來(lái)越多。但由于AD發(fā)病機(jī)制未明，目前尚無(wú)有效的治療方法，給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的AD治療方法已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的迫切課題。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NTFS是由靶細(xì)胞分泌的一組特異性蛋白分子，有促進(jìn)和維護(hù)神經(jīng)元生長(zhǎng)、存活、分化和執(zhí)行功能的作用。神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF是最重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、存活以及凋亡，具有重要的作用。在正常腦內(nèi)，皮質(zhì)和海馬產(chǎn)生的NGF逆向運(yùn)輸?shù)交浊澳X，作用于膽堿能神經(jīng)元的NGF受體NGFR，能提高膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶CHAT水平，防止膽堿能神經(jīng)元萎縮，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元存活，增加存活膽堿能神經(jīng)元的功能，提高學(xué)習(xí)記憶。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，腦室內(nèi)灌注NGF，可使AD模型鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元70％90％維持存活。NGF為生物大分子，靜脈給藥不能透過(guò)血腦屏障，直接腦內(nèi)注射，不僅可能損傷腦組織，帶來(lái)感染風(fēng)險(xiǎn)，還容易引起雪旺細(xì)胞、感覺(jué)和交感神經(jīng)元異常增生等副作用。因而，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥途徑，成為目前需要解決的重大課題?；蜣D(zhuǎn)染是目前能提供長(zhǎng)期療效的治療方法，基因修飾的細(xì)胞腦內(nèi)移植現(xiàn)已成為研究的重點(diǎn)。近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞NSCS作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植、轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞載體和損傷修復(fù)材料，利用神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植治療，或通過(guò)病毒載體將目的基因?qū)肷窠?jīng)干細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變和神經(jīng)損傷的臨床治療帶來(lái)新的曙光。NSCS能夠不斷分裂增殖、具有多分化潛能，可以分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在體內(nèi)可以根據(jù)不同腦區(qū)的微環(huán)境分化成該區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞。這種新的細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)①NSCS在腦中能根據(jù)其周?chē)h(huán)境的誘導(dǎo)而分裂，分化成相應(yīng)的細(xì)胞類(lèi)型，其形態(tài)和功能與附近的宿主細(xì)胞非常類(lèi)似，因而能部分補(bǔ)償損傷和死亡細(xì)胞的功能；②中樞神經(jīng)系統(tǒng)具備特殊的結(jié)構(gòu)血腦屏障，這使得淋巴細(xì)胞在正常情況下很難進(jìn)入，因此不同個(gè)體之間，甚至是不同物種之間的NSCS移植都幾乎沒(méi)有排異反應(yīng)，大大拓寬了NSCS的來(lái)源；③NSCS可以在體外根據(jù)不同的需要導(dǎo)入相應(yīng)的外源基因，成為一種廣譜的細(xì)胞載體。采用NGF基因修飾NSCS，不僅可利用它對(duì)各種神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)作用，而且可利用它維持NSCS的存活，促進(jìn)NSCS分化，使NSCS移植腦內(nèi)后能更大限度地補(bǔ)償損傷和死亡的神經(jīng)元，達(dá)到緩解和改善AD癥狀的目的。目前常用的轉(zhuǎn)基因載體包括一些病毒載體如腺病毒等和陽(yáng)離子脂質(zhì)體等，它們各有不同的特點(diǎn)，目前在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中適于作為短時(shí)期表達(dá)研究。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由于其結(jié)構(gòu)和生命周期的原因，并由于已經(jīng)除去了病毒復(fù)制所必須的包裝順序而不能復(fù)制，只能借助逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，能穩(wěn)定地將外源基因插入和整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并隨細(xì)胞分裂而傳代，提供了一個(gè)高效的、穩(wěn)定的、長(zhǎng)期的目的基因轉(zhuǎn)移手段，適于作為基因轉(zhuǎn)染的載體。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR方法從大鼠海馬組織總RNA擴(kuò)增NGF基因，構(gòu)建含NGF基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，將重組體導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，并進(jìn)行NGF表達(dá)的檢測(cè)及其生物活性鑒定，為探討NSCS基因治療AD動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。結(jié)論1構(gòu)建了神經(jīng)生長(zhǎng)因子逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體PLEGFPNGF。2構(gòu)建了NGF基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞。3基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞能表達(dá)NGF且具有良好的生物學(xué)活性。4神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的NGF能促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。

簡(jiǎn)介：慢性乙型肝炎是當(dāng)前最嚴(yán)重的健康問(wèn)題之一，本論文通過(guò)以具有抗乙肝活性的單體YGT為母體化合物，設(shè)計(jì)、合成一系列YGT衍生物。并對(duì)合成的YGT衍生物進(jìn)行抗乙型肝炎病毒HBV活性篩選。以期發(fā)現(xiàn)抗乙肝病毒活性更強(qiáng)、毒性更小的目標(biāo)化合物。民族藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的寶貴遺產(chǎn)，是我國(guó)創(chuàng)制新藥的重要來(lái)源之一。YGTNN苯甲?；鵏苯丙氨?；鵒乙酰基L苯丙氨醇是從民族藥馬蹄金DICHONDRAREPENSFST分離所得具有抗乙肝活性的化學(xué)成分，其基本骨架在抗乙肝病毒的化合物中未見(jiàn)報(bào)道。由于該化合物在馬蹄金中的含量甚微，水溶性差。為深入研究該類(lèi)化合物抗HBV活性，提高其溶解性，尋找具有抗HBV活性高、毒性低、溶解性好的先導(dǎo)化合物。我們以YGT為母體設(shè)計(jì)了一系列衍生物，并且以L(fǎng)苯丙氨酸、L苯丙氨醇、L酪氨酸和一系列苯甲酸或苯甲酰氯衍生物為原料，通過(guò)硝化、還原、酰化、烷基化、水解、以及用DCCDMAP、IBCFNMM為縮合劑形成酰胺肽鍵等反應(yīng)合成了105個(gè)YGT衍生物。以核磁共振、質(zhì)譜和紅外光譜對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證。以2215細(xì)胞為乙型肝炎病毒載體，對(duì)合成的YGT衍生物樣品抑制乙型肝炎病毒進(jìn)行DNA復(fù)制和產(chǎn)生HBSAG、HBEAG能力進(jìn)行生物活性測(cè)定。采用放射免疫法RIA檢測(cè)細(xì)胞上清中HBSAG、HBEAG的分泌量，斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)細(xì)胞中HBVDNA復(fù)制程度，分別計(jì)算半數(shù)有效濃度IC50及選擇指數(shù)SI。從初步篩選的結(jié)果來(lái)看，編號(hào)NC00112999等9個(gè)樣品對(duì)2215細(xì)胞的HBVDNA復(fù)制有抑制作用，提示這些衍生物可能有抗乙肝病毒的活性。與陽(yáng)性對(duì)照藥拉米夫定比較，衍生物NC00113067和NC00113257對(duì)2215細(xì)胞的HBVDNA復(fù)制有抑制作用較強(qiáng)，取得了較好的階段性研究結(jié)果。下一步研究工作將以此為基礎(chǔ)結(jié)合進(jìn)一步的活性篩選結(jié)果進(jìn)行分析，包括采用計(jì)算機(jī)藥物分子輔助設(shè)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行衍生物的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，合成對(duì)HBVDNA復(fù)制有抑制作用更強(qiáng)的，細(xì)胞毒性較小的、選擇指數(shù)較大的衍生物，爭(zhēng)取尋找到抗乙肝活性較好的先導(dǎo)化合物，為研制治療乙肝的藥物打下基礎(chǔ)。最后，本論文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外抗乙型肝炎病毒HBV的藥物研究概況進(jìn)行了簡(jiǎn)要文獻(xiàn)綜述。

簡(jiǎn)介：HBV是一種多變異的病毒一些重要生物學(xué)功能區(qū)域的核苷酸變異可能導(dǎo)致其生物學(xué)特征的變化該文通過(guò)對(duì)比不同HBE狀態(tài)的前CC區(qū)及其調(diào)控序列探討HBVC基因及其調(diào)控序列變異的多樣性和復(fù)雜性并試圖了解不同區(qū)域的變異熱點(diǎn)與肝炎病變程度的相關(guān)性對(duì)42例慢性乙型肝炎患者中擴(kuò)增的HBVDNA各3個(gè)克隆進(jìn)行直接序列測(cè)定與GENBANK中標(biāo)準(zhǔn)序列ADR亞型比較HBVC基因調(diào)控序列BCP中發(fā)生T1762A1764雙突變者19例其中HBEAG陽(yáng)性者7例HBEAG陰性者12例該突變株與慢性肝炎及HBEAG消失有關(guān)P005另一個(gè)雙突變T1673G1779也與病變程度無(wú)顯著相關(guān)性P005前CA1896變異可發(fā)生于HBV感染的不同臨床狀態(tài)在輕度慢性肝炎中發(fā)生率為222在中度慢性肝炎中發(fā)生率為333在重度慢性肝炎中的發(fā)生率為444在慢性肝炎重度患者中A1896變異檢出率明顯高于慢性肝炎輕度患者在慢性乙型肝炎病人中每個(gè)病例的HBVC區(qū)均有數(shù)量不等的變異在AA5、AA27、AA38、AA60、AA87、AA97、AA130、AA135這幾個(gè)變異熱點(diǎn)中輕度慢性肝炎患者中發(fā)生氨基酸替代合計(jì)23個(gè)中度慢性肝炎患者中發(fā)生氨基酸替代合計(jì)33個(gè)重度慢性肝炎患者中發(fā)生氨基酸替代合計(jì)40個(gè)隨著病情嚴(yán)重程度的增加C區(qū)氨基酸替代隨病變程度的加重而增加可能是由于這些病例在HBV的持續(xù)性感染中變異株長(zhǎng)期積累所致以上結(jié)果表明慢性乙型肝炎病人的HBVC基因及其調(diào)控序列變異具有多樣性和復(fù)雜性與體內(nèi)的免疫清除和病毒逃避免疫攻擊相關(guān)從而容易導(dǎo)致疾病的慢性化

簡(jiǎn)介：一、研究背景和目的馬傳染性貧血病毒EIAV與人免疫缺陷病毒HW、猴免疫缺陷病毒SIV、貓免疫缺陷病毒FIV、牛免疫缺陷病毒BIV、綿羊梅迪維斯納病毒MVV和山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒CAEV同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬是嚴(yán)重危害人類(lèi)和動(dòng)物健康的病原體214。它們?cè)诨蚪M結(jié)構(gòu)、病毒復(fù)制的分子機(jī)制、抗原漂移、細(xì)胞噬性、病毒的生活周期、免疫機(jī)理及病毒與宿主相互作用等方面都極為相似。其共同特點(diǎn)是侵害宿主免疫系統(tǒng)在單核巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞內(nèi)持續(xù)增歹直36。但EIAV作為慢病毒屬的一員除具有一些慢病毒共同特性外還有其獨(dú)具的特性3～5。EIAV潛伏期只有幾天至幾周而不像其他慢病毒屬高達(dá)幾年而且可產(chǎn)生高滴度的病毒血癥、劇烈的臨床病理學(xué)表現(xiàn)3031在EIAV感染過(guò)程中新的抗原變異株的出現(xiàn)與疾病復(fù)發(fā)相關(guān)因此其是研究慢病毒與宿主相互作用過(guò)程中抗原變異的極好模型32；與其它慢病毒感染明顯不同的是慢性EIAV感染經(jīng)歷一年左右的時(shí)間變?yōu)殡[性感染病毒的表達(dá)長(zhǎng)期被抑制大部分馬在感染EIAV后有正常的壽命部分感染馬最終能控制住病毒的復(fù)制。因此鑒定這種免疫保護(hù)機(jī)制對(duì)于慢病毒疫苗的研制具有重要的指導(dǎo)意義。我國(guó)科學(xué)家在20世紀(jì)70年代利用經(jīng)典的異體傳代和細(xì)胞工程方法將一株來(lái)源于馬體的EIAV超強(qiáng)毒力毒株LN經(jīng)過(guò)驢體連續(xù)傳代115余代使病毒毒力增強(qiáng)后獲得了驢強(qiáng)毒株DV對(duì)馬和驢均100％致死然后將DV株連續(xù)通過(guò)驢白細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)馴化使得病毒毒力完全喪失而保持了良好的免疫原性最終成功培育出EIAV驢白細(xì)胞弱毒疫苗DLA6沈榮顯等1979該疫苗免疫接種動(dòng)物不僅能產(chǎn)生強(qiáng)大持久的免疫力而且能抵抗同源和異源強(qiáng)毒株的攻擊。即使強(qiáng)毒株攻擊免疫動(dòng)物其也不受感染。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的安全檢驗(yàn)此疫苗在中國(guó)廣泛推廣使用使得馬傳染性貧血病在中國(guó)得以有效控制。到目前為止該疫苗是世界上唯一成功應(yīng)用的慢病毒弱毒疫苗。接種該疫苗后的馬能耐受致死劑量的EIAV的攻擊。這也使得我國(guó)EIAV弱毒疫苗免疫保護(hù)及致弱的機(jī)理研究成為當(dāng)今慢病毒免疫基礎(chǔ)理論研究的熱點(diǎn)之一。其傳代培養(yǎng)致弱的分子機(jī)制及弱毒、強(qiáng)毒與接種動(dòng)物相互作用的致病、免疫機(jī)制都將豐富慢病毒的基本理論并將為包括HIV在內(nèi)的其它慢病毒疫苗的研制提供重要的理論依據(jù)。自上世紀(jì)八十年代在發(fā)現(xiàn)HIV1以后全球更是對(duì)EIAV的分子生物學(xué)展開(kāi)了廣泛研究并取得了很多成果456尤其是反向遺傳技術(shù)的發(fā)展為慢病毒的研究提供了新的思路。利用該技術(shù)在1998年成功構(gòu)建的幾株不同毒力的EIAV感染性分子克隆為揭示病毒毒力及其與宿主相互作用的機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。馬慢病毒受體1ELRL是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的2005315其屬于腫瘤壞死因子受體超家族蛋白目前認(rèn)為它是EIAV的唯一受體。EIAV的ENV基因編碼GP90和GP45糖蛋白。表面糖蛋白存在于病毒囊膜中大小約為90KDA是高度糖基化的蛋白構(gòu)成病毒纖突的柄與宿主細(xì)胞膜上的受體相互作用。EIAV進(jìn)入靶細(xì)胞的方式是病毒囊膜中的GP90與受體ELRL結(jié)合在低PH環(huán)境下PH4853經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞4。其能夠單獨(dú)支持EIAV血清強(qiáng)毒和細(xì)胞適應(yīng)毒進(jìn)入非EIAV靶細(xì)胞進(jìn)行增殖但研究表明其發(fā)揮效應(yīng)時(shí)可能需要其它輔助受體的共同作用同時(shí)是否像HIV一樣有輔助受體的存在尚無(wú)定論。在感染性克隆上加入熒光基團(tuán)標(biāo)記物標(biāo)記將有助于潛在受體的確定16。本文對(duì)已有的疫苗株感染性克隆進(jìn)行GFP分子標(biāo)記并將構(gòu)建的感染性克隆進(jìn)行拯救包裝出活的病毒顆粒藉此研究馬傳染性貧血病毒與宿主細(xì)胞之間潛在的受體相互作用的致病機(jī)制以及疫苗保護(hù)效應(yīng)的因?yàn)?。此外論文?nèi)容還將實(shí)驗(yàn)中片段連接的SOEPCR技術(shù)12578做了部分的拓展和延伸通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)改進(jìn)可以實(shí)現(xiàn)在單管反應(yīng)中的多片段連接。希望本文中的部分內(nèi)容可以為相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)人員提供參考。二、研究方法利用SOEPCR技術(shù)設(shè)計(jì)重疊的互補(bǔ)堿基的引物實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增過(guò)程中的兩片段延伸反應(yīng)快速的實(shí)現(xiàn)基因的人工合成。該技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用主要包括感染性克隆的構(gòu)建、病毒基因組測(cè)序、病毒的遺傳變異分析、限制性片段多態(tài)性分析以及基因分型等方面。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)也是基于此技術(shù)進(jìn)行的。利用SOEPCR技術(shù)在已有的EIAV感染性分子克隆中加入帶有熒光標(biāo)記物EGFP進(jìn)行標(biāo)記。為研究增強(qiáng)型綠色熒光蛋白ENHANCEDGREENFLUESCENTPROTEINEGFP基因在活細(xì)胞中作為報(bào)告基因和篩選標(biāo)記的可行性利用分子克隆技術(shù)將質(zhì)粒PIRES2EGFP片段定點(diǎn)插入到EIAV感染性克隆624氐拷貝表達(dá)載體上構(gòu)建為重組質(zhì)粒PLGGFP38。GFP是一種27KDA的單體20由238個(gè)氨基酸構(gòu)成本身就是一個(gè)生物發(fā)光系統(tǒng)附帶有激發(fā)后能發(fā)射生物熒光的發(fā)光色基其發(fā)光過(guò)程不同于其它生物發(fā)光組織是不需熒光素酶參與的。GFP色基是由絲氨酸酪氨酸甘氨酸SERTYGLY形成的環(huán)化三肽所構(gòu)成并且只有色基包被在完整的GFP蛋白中才能發(fā)出熒光CODYETAL1993被切斷的GFP即使是C末端的少數(shù)幾個(gè)氨基酸亦能導(dǎo)致GFP失去發(fā)光能力。光激發(fā)GFP熒光是一個(gè)特異性的獨(dú)立過(guò)程并不需要任何的協(xié)同因子、底物或其它來(lái)自于水母的基因表達(dá)產(chǎn)物。當(dāng)能量由CA2激活光蛋白AEQUIN傳給GFP時(shí)引發(fā)熒光WARDETAL1980。當(dāng)GFP在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)并受到藍(lán)光或紫外光輻照時(shí)就可發(fā)出亮綠色熒光。EGFP16是GFP突變系。EGFP發(fā)生了雙氨基酸取代LEU亮氨酸取代PHE64苯丙氨酸THR蘇氨酸取代SET65絲氨酸。EGFP在488NM處激發(fā)后燈熒光強(qiáng)度為WTGFP的35倍20。一般真核MRNA的翻譯都需要5帽子來(lái)介導(dǎo)核糖體結(jié)合微小RNA病毒家族則例外。這類(lèi)病毒在其MRNA前沒(méi)有帽子位點(diǎn)但卻有600～1200BP的5非翻譯區(qū)其中含有多個(gè)非起始AUG這段長(zhǎng)的非翻譯區(qū)叫做內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列INTERNALRIBOSOMEENTRYSITEIRES。IRES能招募核糖體對(duì)MRNA進(jìn)行翻譯。將IRES與外源CDNA融合發(fā)現(xiàn)IRES能獨(dú)立地起始翻譯。在構(gòu)建好帶有熒光標(biāo)記的感染性克隆株后我們進(jìn)一步的采用293FT細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染包裝拯救使病毒恢復(fù)為具有感染力的病毒顆粒。293細(xì)胞是轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人腎上皮細(xì)胞系293T以及293FT細(xì)胞由293細(xì)胞派生同時(shí)表達(dá)SV40大T抗原含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)與啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)?？梢詮?fù)制。用穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作可以方便的進(jìn)行轉(zhuǎn)染。蛋白表達(dá)水平高轉(zhuǎn)染后可以通過(guò)分析熒光表達(dá)強(qiáng)度可較容易地檢測(cè)到表達(dá)的蛋白。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞是過(guò)表達(dá)蛋白并獲得細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外分泌的或膜蛋白的便捷方式。慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒需要利用表達(dá)重組后的感染性克隆載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中離心取得上清液后可以直接用于宿主細(xì)胞的感染目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄整合到基因組從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。為后續(xù)打下基礎(chǔ)藉此研究病毒抗原和受體之間相互作用的致病機(jī)制。三、結(jié)果與結(jié)論本研究對(duì)SOEPCR技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)在加入一定稀釋度的中間引物后能夠?qū)崿F(xiàn)3個(gè)片段的直接連接。利用該技術(shù)對(duì)已有的馬傳染性貧血病毒疫苗株感染性克隆進(jìn)行EGFP分子標(biāo)記測(cè)序結(jié)果表明長(zhǎng)度為42KB的大片段其突變的堿基數(shù)為一個(gè)堿基。在后續(xù)的對(duì)該技術(shù)的進(jìn)一步研究表明利用該技術(shù)可完成5片段的總長(zhǎng)度為8KB的大片段連接擴(kuò)大了多片段連接范圍在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚無(wú)進(jìn)行如此大片段多片段連接成功的報(bào)道。將構(gòu)建的帶EGFP分子標(biāo)記的馬傳染性貧血病毒疫苗株感染性克隆進(jìn)行拯救以包裝出能表達(dá)EGFP的具有感染性的病毒顆粒藉此研究馬傳染性貧血病毒與宿主細(xì)胞之間潛在的受體相互作用的致病機(jī)制以及疫苗保護(hù)效應(yīng)的因?yàn)?。?shí)驗(yàn)尚在進(jìn)行中初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用電穿孔的方法對(duì)293FT細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒穿孔操作穿孔細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)在熒光顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可釋放出了熒光為下一步實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：本研究嘗試用人皮膚成纖維細(xì)胞作為HBMP2基因攜帶細(xì)胞。本研究分三部分第一部分非病毒載體PCDNA3HBMP2的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞后HBMP2基因的表達(dá)，研究結(jié)論非病毒載體可成功介導(dǎo)HBMP2基因進(jìn)入人皮膚成纖維細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平獲得目的基因的表達(dá)。第二部分非病毒載體轉(zhuǎn)染HBMP2基因后人皮膚成纖維細(xì)胞的成骨潛能研究，研究結(jié)論經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PCDNA3HBMP2的人皮膚成纖維細(xì)胞可表達(dá)部分成骨表型，但未能完全轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞并誘導(dǎo)成骨，應(yīng)進(jìn)一步改善載體。第三部分兩種攜帶HBMP2基因的真核表達(dá)載體間的比較，研究結(jié)論新建載體未能有效增強(qiáng)HBMP2基因在人皮膚成纖維細(xì)胞的表達(dá)。

簡(jiǎn)介：本文簡(jiǎn)要介紹了致病性漢坦病毒HANTAVIRUS，HV的5種血清型別，以及目前在我國(guó)流行的漢坦病毒為HTN型和SEO型。這兩型病毒的動(dòng)物宿主、流行病學(xué)特點(diǎn)和所引起的臨床癥狀輕重明顯不同，預(yù)防性疫苗的使用也需要有針對(duì)性，故對(duì)其進(jìn)行分型檢測(cè)非常必要。由于漢坦病毒在體外傳代細(xì)胞中生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，PRNT不僅需時(shí)長(zhǎng)通常需要7天以上時(shí)間，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作技術(shù)的要求較高，普通醫(yī)療單位難以開(kāi)展本研究應(yīng)用基因重組技術(shù)對(duì)HTNV76118株和SEOVL99株NP及其截短的片斷進(jìn)行融合表達(dá)，分析了重組蛋白的抗原性，通過(guò)探索這些片段的抗原性，希望建立一種HV感染的快速簡(jiǎn)便的血清分型ELISA方法。為了解疫區(qū)人、鼠之間的疫情動(dòng)態(tài)、流行因素及發(fā)展趨勢(shì)，疫區(qū)型別和型別變化的監(jiān)測(cè)，以及有效的預(yù)防和治療都提供了依據(jù)。