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簡介：前言血液凈化是把患者血液引出體外并通過一種凈化裝置，除去其中某些致病物質(zhì)，凈化血液，達到治療疾病目的的過程。血液透析HEMODIALYSIS，HD是血液凈化的主要方式，是急、慢性腎功能衰竭病人延長生命的主要手段，但腎衰竭病人大多免疫功能受到損害，并可能伴有營養(yǎng)不良、貧血等情況，極易合并感染，而感染血源性傳染病會顯著影響HD患者的長期存活質(zhì)量，增加患者的經(jīng)濟和精神負擔。因此，近幾年來HD患者中病毒性肝炎感染問題受到廣泛關(guān)注。目前沈陽市關(guān)于HD患者中病毒性肝炎感染情況的研究尚屬空白，所以，現(xiàn)就沈陽市近3年HD患者乙型、丙型病毒性肝炎感染現(xiàn)狀及特征進行調(diào)查研究。為制定有效預(yù)防HD患者感染乙型、丙型病毒性肝炎的政策措施，提供理論依據(jù)。實驗方法一、研究對象的選擇及入選標準在沈陽市城區(qū)有血液透析項目的醫(yī)院中，隨機抽取2家省級醫(yī)院、2家市級醫(yī)院、2家市級以下醫(yī)院，在2006年2008年每年的10月份調(diào)查6家醫(yī)院的所有在院血液透析病例，選擇基礎(chǔ)性疾病為腎病的病例，共576例。二、調(diào)查內(nèi)容及方法以查閱病歷和現(xiàn)場詢問的方式填寫調(diào)查表，調(diào)查內(nèi)容包括患者年齡、性別、透析年限、透析頻率、累計透析次數(shù)、乙肝疫苗接種史、乙肝五項及丙肝抗體等指標。三、診斷標準1、乙肝病毒HBV感染者HBV感染者指乙肝表面抗原HBSAG、乙肝表面抗體HBSAB，排除接種乙肝疫苗者、乙肝E抗原HBEAG、乙肝E抗體HBEAB、乙肝核心抗體HBCAB中有1項陽性者。2、丙肝病毒HCV感染者HCV感染者指丙肝抗體抗HCV陽性者。四、資料分析調(diào)查資料經(jīng)質(zhì)量檢查后，將數(shù)據(jù)錄入SPSS115軟件，進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計學上的顯著性水平規(guī)定為Α005。實驗結(jié)果一、HD患者乙型、丙型肝炎感染情況及分布特征1、感染率共調(diào)查576例，檢出HBV感染標志物陽性265例刪除有明確乙肝疫苗接種史的而且HBSAB陽性者，總感染率為460％。檢出HCV感染標志物陽性24例，總感染率為42％。2、經(jīng)卡方檢驗，2006年2008年、各等級醫(yī)院、以及不同性別之間乙型、丙型肝炎感染情況無統(tǒng)計學意義。P005二、單因素及多因素分析性別、年齡、透析年限、累計透析次數(shù)、醫(yī)院等級5項因素分析結(jié)果均無統(tǒng)計學意義P005，即與乙型、丙型肝炎感染無關(guān)。透析頻次具有統(tǒng)計學意義P005，可能與乙型、丙型肝炎感染有關(guān)，是HD患者感染乙型、丙型肝炎的危險因素。三、HD患者乙型、丙型肝炎感染關(guān)系分析根據(jù)HD頻次將病例分為2組，結(jié)果有統(tǒng)計學意義P005。討論研究結(jié)果顯示，沈陽市HD患者乙肝感染率為46％，高于一般人群的乙肝感染率。究其原因，一方面可能是我國人群中乙肝感染率較高，有些乙肝感染者同時又有腎臟疾??；另一方面可能與HD患者普遍存在細胞免疫缺陷有關(guān)。本調(diào)查顯示沈陽市HD患者丙肝感染率為42％，略高于我國一般人群感染率，但遠低于國內(nèi)外有關(guān)報道的水平。可見，我市HD患者乙型、丙型肝炎感染率雖高于一般人群，但處于同比較低水平，這說明我市感染控制工作比較到位，基本有效預(yù)防了HD患者乙型、丙型肝炎感染的發(fā)生。調(diào)查分析結(jié)果顯示，2006年2008年三年之間，在男、女之間及各等級醫(yī)院之間的乙型、丙型肝炎的感染率無統(tǒng)計學意義?？赡芘c近3年來我市采取了隔離陽性病人等有效的預(yù)防控制措施，確實無感染事件的發(fā)生有關(guān)。國外有研究證明，HD患者感染HBV與維持血透的時間呈正相關(guān)，而國內(nèi)研究顯示其關(guān)系不密切，這一點與本次研究的結(jié)果一致。這可能與我國多年來實行血源HBV篩選等預(yù)防控制措施有關(guān)。本次研究結(jié)果顯示HD患者HCV感染與透析年限無關(guān)，可能是由于我市醫(yī)療機構(gòu)的感染控制工作較好，也可能是受到現(xiàn)有的用于篩選HCV感染的方法靈敏度的影響。因此，進一步的HCV感染的研究還有待于檢驗方法的改進。通過單因素及多因素分析，性別、年齡、透析年限、累計透析次數(shù)、醫(yī)院等級5項因素均未發(fā)現(xiàn)與HD患者感染乙型、丙型肝炎有關(guān)，均在一定程度上說明我市各血液透析中心在感染控制方面做的較好。本研究表明透析頻次次周可能為HD患者乙型、丙型肝炎感染的危險因素，但在相關(guān)的研究中并未發(fā)現(xiàn)一致報道。分析原因可能是透析頻次容易被有些學者忽略，而主要以透析年限、累計透析次數(shù)為研究重點。實際上，透析頻次作為危險因素是有一定理論基礎(chǔ)的。透析頻次恰恰決定了患者之間接觸的頻次，也就是感染機會的大小。因此，可以說透析頻次有影響HD患者感染乙型、丙型肝炎的可能性。另一方面，不同HD頻次組間的差別提示HD患者感染乙型、丙型肝炎的危險性有隨HD頻次增加而增加的可能。近年來，美國和歐洲終末期腎臟疾病HD患者乙型肝炎的發(fā)病率和患病率均有所下降，這極大程度歸功于預(yù)防概念的推廣?？梢?，有效控制血液透析各環(huán)節(jié)可能的感染是預(yù)防HD患者感染乙型、丙型病毒性肝炎的重要措施。本研究表明我市HD患者近3年來乙型、丙型病毒性肝炎感染率能夠維持在較低水平，說明我市醫(yī)療機構(gòu)在感染控制、輸血管理及免疫接種等方面的工作取得了一定成效。結(jié)論本研究結(jié)果提示，透析頻次次周可能為血液透析患者感染乙型、丙型肝炎病毒的危險因素。且感染的危險性有隨透析頻次的增加而增加的可能。

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簡介：點擊查看更多多種乙型肝炎病毒突變株可調(diào)控性表達細胞系的構(gòu)建.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：第一部分基因1B型丙型肝炎病毒核心蛋白與蛋白激酶R、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3相互作用的區(qū)域定位丙型肝炎病毒HCV核心蛋白CE是構(gòu)成病毒的核殼蛋白在HCV持續(xù)感染及肝癌HCC的發(fā)病機制中起重要作用本課題進一步對CE與PKR、STAT3相互作用進行了研究并對相互作用所依賴的功能區(qū)域進行了定位提出了三者相互作用的模式探討三者在HCV致病機制為抗HCV治療提供新的靶位結(jié)論1不同片段CE原核表達質(zhì)粒構(gòu)建為研究基因1B型不同病毒株不同區(qū)段CE的結(jié)構(gòu)、抗原性、分子免疫、生物學特性及其功能研究奠定了基礎(chǔ)2基因1B型HCV編碼的CE、PKR和STAT3可能直接結(jié)合在一起形成異三聚體CE通過PKR和STAT3發(fā)揮其功能CE與STAT3的結(jié)合或激活STAT3是繼發(fā)于CEPKR的相互作用或CEPKR相互作用后PKR的激活3CE與PKR及STAT3相互作用是基因1B型HCV感染又一新的分子致病機制可能在引起HCV持續(xù)感染和HCC的發(fā)病機制中起重要作用第二部分不同截短片段基因1B型HCV核心蛋白功能研究目的研究不同截短片段CE在HCV持續(xù)感染及肝癌發(fā)病機制的作用結(jié)論不同片段CE在HCV持續(xù)感染及肝癌發(fā)病機制中的作用及分子致病機制存在一定的差異

簡介：第四軍醫(yī)大學博士學位論文重組腺病毒載體ADNT3/ADLACZ轉(zhuǎn)染體內(nèi)、外雪旺細胞的實驗研究姓名朱錦宇申請學位級別博士專業(yè)外科學骨外指導(dǎo)教師黃耀添200051第四軍醫(yī)大學博士學位論文MOIMULTIPLICITYOFINFECTIONBGAL13GALACTOSIDASEABCAVIDINBIOTINPEROXIDASECOMPLEXDAB3,3’一DIAMINOBENZIDINETETRAHYDROCHLOFIDEBPBASEPAIRSPBSPHOSPHATEBUFFEREDSALINEODOPTICALDENSITYMTTTHIAZOLYLBLUEEDTAETHYLENEDIAMINETETRAACETICACIDTRISHCLTRISHYDUOXYMETHYLAMINOMETHANEDMEMDULBECCOMODIFIEDEAGLE’SMEDIUM感染增殖率B一半乳糖苷酶親合素一生物素一過氧化物酶復(fù)合物二氨基聯(lián)苯胺堿基對磷酸鹽緩沖液光密度噻唑藍乙二胺四乙酸三羥甲基氨基甲烷改良的EAGLE氏培養(yǎng)基

簡介：點擊查看更多丙型肝炎病毒基因型與肝細胞癌相關(guān)性的分子病理學研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：點擊查看更多漢坦病毒體外誘導(dǎo)HSP70表達的定量研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：本研究旨在探討P7蛋白在丙型肝炎病毒（HCV）致病過程中的作用。應(yīng)用抑制性消減雜交SSH技術(shù)，構(gòu)建P7反式調(diào)節(jié)相關(guān)基因差異表達的CDNA消減文庫，篩選相關(guān)的靶基因片段，將產(chǎn)物與TA載體連接，構(gòu)建CDNA消減文庫，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行文庫擴增，隨機挑選克隆，PCR擴增后進行測序及同源性分析。對轉(zhuǎn)染后的細胞裂解液同時應(yīng)用基因表達譜芯片技術(shù)對差異表達MRNA進行檢測和分析；構(gòu)建去唾液酸糖蛋白受體1ASGPRL啟動子的報告基因載體PCAT3ASGPRLP，并以其轉(zhuǎn)染肝癌HEPG2細胞系，用ELISA法檢測CAT的表達活性，并與PCDNA31P7共轉(zhuǎn)染HEPG2細胞系，用ELISA法檢測CAT的表達活性。研究結(jié)論P7蛋白對SV40啟動子具有反式調(diào)節(jié)功能；篩選到的CDNA全長序列，包括一些與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞生長調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)翻譯合成、物質(zhì)代謝、細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的蛋白編碼基因，推測了P7在體內(nèi)可能存在的調(diào)控機制的線索；P7具有對ASGPRL基因有上調(diào)作用。

簡介：中南大學博士學位論文EB病毒致瘤蛋白LMP1調(diào)節(jié)P53功能活性的研究姓名李力力申請學位級別博士專業(yè)病理學與病理生理學指導(dǎo)教師曹亞20070501能活性。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)病毒致瘤蛋白LMPL通過調(diào)節(jié)P53表達的增加，導(dǎo)致細胞G2／M期行進過程中重要的正性調(diào)節(jié)因子CDC2／EYCLINB1復(fù)合物激酶活性下降，使其停滯于G2／M期。這提示我，F(xiàn)1“P53作為一個受EB病毒LMPL調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在細胞周期調(diào)節(jié)中具有重要的功能。除此之外，已有研究表I明LMPL通過P53上調(diào)抗凋亡基因A20，BCL2，SURVIVIN和△NP63抑制凋亡的發(fā)生。故LMPL介導(dǎo)P53增加而不誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，LMPL通過調(diào)節(jié)P53從而穩(wěn)定EB病毒的潛伏感染，促進上皮細胞的轉(zhuǎn)化，有助于宿主和病毒之間平衡的維持。這為我們從一個新的視野來研究和理解P53在EB病毒感染中的病理生理學意義提供了新的啟示。一直以來，關(guān)于EB病毒轉(zhuǎn)化作用的研究都是在非鼻咽上皮來源和非上皮細胞來源的細胞中進行的，EB病毒感染和其編碼的致瘤蛋白LMPL所參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究局限于腫瘤細胞中完成，不能充分闡明癌變多階段演進過程中的分子機理以及遺傳因素和環(huán)境因素在癌變過程中的相互作用關(guān)系。在國家自然科學基金委與香港研究資助局聯(lián)合科研資助基金NO30418004的資助下，我們引進了體外處于癌變早期階段的實驗?zāi)Ｐ推脚_NP69、轉(zhuǎn)染了空白載體PLNSX的NI，69巾LNSX和轉(zhuǎn)染TLMPL的NP69LMPL細胞模型。因此，利用永生化的鼻咽上皮NP69細胞模型探討腫瘤的發(fā)病機理是一個很好的切入點。我們首先對NP69細胞模型中P53的特征進行了研究，在該模型中證實有大量游離的、野生型的P53的存在，HLMPL不僅能促進P53的核積聚，同時還促進P53的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白水平的表達。這為我們進一步利用該細胞模型研究致瘤蛋白LMPL調(diào)節(jié)P53功能活化的分子機制提供了重要的基礎(chǔ)。Ⅱ

簡介：第一軍醫(yī)大學碩士學位論文乙型肝炎病毒HBV宮內(nèi)傳播及免疫前后HBVS基因變化的研究姓名郭培奮申請學位級別碩士專業(yè)婦產(chǎn)科學指導(dǎo)教師鐘梅200151摘要目的了解HBV的母嬰垂直傳播情況，觀察HBIG聯(lián)合HBVAC預(yù)防接種高危嬰兒的效果，了解發(fā)生宮內(nèi)傳播的HBV基因組變化特點及基因分型，探討不能成功預(yù)防接種的新生兒，其母嬰感染的TIBV在基因方面可能的原因。、方法現(xiàn)狀調(diào)查與病例對照研究，收集圍生期婦女、新生兒、不同月齡嬰兒血標本，ELISA、NESTEDPCR法檢測血清HBVM及HBVDNA，PERRFLP法對宮內(nèi)感染HBV基因分型，直接檢測核苷酸序列，分析宮內(nèi)感染或不能免疫成功的嬰兒耶VS基因堿基突變情況。結(jié)果共收集135例母血、139例新生兒，其中4對為雙胎。宮內(nèi)感染率為54％；孕婦RMEAG陽性，HBV宮內(nèi)感染率為130％；孕婦HBEAG陌性，HBV宮內(nèi)感染率為11％。HBIG200U兩針聯(lián)合HBVAC10UG0、L、6方案預(yù)防接種及單純HBVACLOUG0、1、6預(yù)防接種兩種方案均具有良好的保護效果。7例宮內(nèi)傳播IIBV病毒分型，以C、B基因型為主。母嬰HBV的同源性均985％。S基因出現(xiàn)了堿基改變，以‘A’一決定簇內(nèi)變異為主，同時存在該決定簇以外的變異160號的126位由脯氨酸P蘇氨酸T。176號母親的第139、141位AA發(fā)生R替換，176號嬰兒僅在第143位脯氨酸P蛋氨酸M，6月齡復(fù)查時卻變成了蘇氨酸T；101號標本第196位由色氨酸W一亮氨酸L。130號母親HBV有570位堿基改變，致196位色氨酸W一絲氨酸S，全程免疫后，其嬰兒出現(xiàn)第145位氨基酸GLY一時G，該組家庭的母親及新生兒均未檢測到這一變異。145位AA變異亦見于對照組。結(jié)論HBVAC聯(lián)合HBIG免疫高危新生兒有良好的保護效果，但仍有部分嬰兒不能免疫成功。宮內(nèi)傳播HBVDNA堿基可發(fā)生替換，但未出現(xiàn)在基因分型的酶切位點上，ITBV垂直傳播時基因型保持一致。HBIG聯(lián)合IIBVAC免疫壓力下，HBV出現(xiàn)新的變異，關(guān)鍵詞乙型肝炎病毒’宮內(nèi)感染宮內(nèi)傳播。感染率基因型序列分析

簡介：乙型腦炎病毒JAPANESEENCEPHLITICVIRUSJEV和西尼羅病毒W(wǎng)ESTNILEVIRUSWNV同屬于蟲媒病毒黃病毒科，黃病毒屬、乙型腦炎病毒抗原復(fù)合組JAPANESEENCEPHALITISVIRUSSEROCOMPLEXGROUP的成員。該復(fù)合組成員病毒屬于蚊媒病毒，主要由鳥類攜帶，經(jīng)蚊蟲傳播給人，也可以感染其它哺乳動物，引起多種臨床癥狀，包括發(fā)熱，甚至腦炎及腦膜炎，重者可致死。近年來，該組成員中的西尼羅病毒流行已經(jīng)給人類的健康造成嚴重的損害和威脅。國外將西尼羅熱歸于新發(fā)傳染病EMERGINGINFECTIOUSDISEASE范疇，我國國家衛(wèi)生部將西尼羅熱歸于可能傳入的新發(fā)傳染病。早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防WNV的傳播是控制西尼羅熱爆發(fā)流行的主要措施，檢測蚊蟲體內(nèi)的WNV感染率是西尼羅病毒傳播預(yù)警的一個直觀指標。從人員和設(shè)備需求來看，快速免疫檢測方法具有明顯的優(yōu)勢。黃病毒是正鏈RNA病毒。以西尼羅病毒為例，它由10962個核苷酸組成，其開放讀碼框編碼病毒3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中包膜蛋白E和膜蛋白M是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，可能與病毒的毒力及侵襲性有關(guān)，也是病毒的主要抗原。但是，由于黃病毒屬成員間在病毒表面尤其是E蛋白上存在許多共同的抗原表位，所以在血清學檢測時容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，使反應(yīng)結(jié)果特異性不高。文獻報道，針對登革病毒M蛋白的前體PRM蛋白的單克隆抗體與乙腦病毒抗血清無交叉反應(yīng)，提示在PRM蛋白上可能存在病毒特異性抗原表位。為了探索高效、靈敏的檢測WNV方法，本研究分別克隆了JEV和WNVPRM基因，并原核表達，制備分別針對JEV和WNVPRM蛋白的特異性單克隆抗體，用于JEV復(fù)合組成員感染的鑒定、鑒別診斷和流行病學研究。首先，本研究采用JEV疫苗株免疫BALBC小鼠，制備單克隆抗體，經(jīng)過五次亞克隆篩選，獲得分泌針對JEV疫苗株的單抗的雜交瘤細胞株V6B9，抗體亞型為IGG1，抗體滴度為105。ELISA、WESTERNBLOT和免疫組化檢測結(jié)果證實該株單抗能夠與JEV感染鼠腦上清中的病毒，以及與WNV反應(yīng)。該抗體可用于JEV復(fù)合組病毒的初步篩選。同時，本研究采用RTPCR方法，從人工接種感染JEV疫苗株SA14142株的鼠腦中克隆編碼JEVPRM蛋白的基因，將基因克隆入原核表達載體PET32A后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3LYSS，以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達后利用NINTA進行純化。用純化的蛋白免疫BALBC小鼠，經(jīng)ELISA法檢測表明，小鼠能夠產(chǎn)生針對重組西尼羅病毒PRM的抗體。經(jīng)細胞融合和亞克隆后篩選出能分泌識別PRM蛋白MAB的雜交瘤細胞株P(guān)1F2，抗體亞型為IGG1，抗體滴度為105。經(jīng)ELISA、WESTERNBLOT和免疫組化檢測結(jié)果證實該株單抗能特異性地識別JEVPRM蛋白和JEV疫苗株，并且與WNVPRM蛋白無交叉反應(yīng)。最后，參照GENEBANK報道的WNV基因組序列，合成編碼PRM基因，用同樣的方法將其克隆入原核表達載體并進行表達純化。將純化產(chǎn)物免疫小鼠制備單抗，獲得了能分泌識別PRM蛋白MAB的雜交瘤細胞株2株，抗體亞型為IGG1，抗體滴度為105～106。ELISA、WESTERNBLOT檢測證實，所獲得的單抗能夠識別西尼羅病毒PRM蛋白和WNV抗原，并與乙型腦炎病毒疫苗株無交叉反應(yīng)。以上兩種針對PRM蛋白的單克隆抗體可用于乙型腦炎病毒組病毒的特異性檢測。本研究所制備的抗JEV和抗WNV單克隆抗體，檢測方法具有特異、靈敏、快速的優(yōu)點，可為WNV和JEV的流行病學監(jiān)測，以及黃病毒組病毒感染的快速鑒別診斷提供有力的工具。更為重要的是，為進一步探索WNVPRM蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)；同時，其后續(xù)試驗資料也可為WNV疫苗的研究提供候選抗原。

簡介：戊型肝炎HE是戊型肝炎病毒HEV引起的一種急性病毒性肝炎該文首先依據(jù)四個主要基因型亞洲非洲基因型、墨西哥基因型、美國基因型和中國基因型的F2區(qū)的核酸序列合成通用性引物采用逆轉(zhuǎn)錄套式PCRRTNPCR法檢測了江蘇地區(qū)20例戊型肝炎患者的糞便中HEVRNA結(jié)果陽性14例陽性率為70﹪該研究通過對血清中抗HEVIGG陽性的戊型肝炎患者糞例中HEVRNA進行檢測確保了標本來源的可靠性為所構(gòu)建噬菌體抗體庫的特異性提供了保證應(yīng)用近幾年來發(fā)展起來的噬菌體展示技術(shù)在國內(nèi)外首次構(gòu)建了人源性戊型肝炎病毒噬菌體抗體庫為抗HEV重組抗原的中和性噬菌體抗體的篩選人源特異性HEV中和性單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)從而為HEV感染的特異性治療和被動免疫、發(fā)病機理及診斷等進一步研究奠定基礎(chǔ)

簡介：目的探討MIR122對乙型肝炎病毒HBSAG、HBEAG表達的影響。方法以空白對照組陰性對照組GFP反義寡核苷酸序列組為陰性對照設(shè)計合成2條MIR122的反義寡核苷酸序列ANTIMIR122LNAANTIMIR122反義鎖核苷酸以及人MIR122的寡核苷酸序列HSAMIR122。脂質(zhì)體包裹后分別以400NMLGFP組400NMLANTIMIR122組40NMLLNAANTIMIR122組400NMLHSAMIR122轉(zhuǎn)染HEPG2215細胞。細胞轉(zhuǎn)染24小時48小時后取培養(yǎng)液上清時間分辨熒光免疫法檢測HBSAGHBEAG的表達。轉(zhuǎn)染48小時后提取總RNATAQMAN技術(shù)實時熒光定量PCR檢測ANTIMIR122組LNAANTIMIR122組HSAMIR122組GFP組和陰性對照組內(nèi)細胞MIR122的含量。結(jié)果①轉(zhuǎn)染24小時后HBSAG表達HSAMIR122組HBSAG表達低于陰性對照組P005HASMIR122組HBSAG表達低于ANTIMIR122組P001ANTIMIR122組HBSAG表達高于GFP組P001。②轉(zhuǎn)染24小時后HBEAG表達ANTIMIR122組HBEAG表達高于陰性對照組P001LNAANTIMIR122組HBEAG表達顯著高于陰性對照組P001HSAMIR122組HBEAG表達低于ANTIMIR122組P001GFP組HBEAG表達低于ANTIMIR122組P001。③轉(zhuǎn)染48小時后HBSAG表達GFP組相對于陰性對照組HBSAG表達兩者沒有差異P1000ANTIMIR122組HBSAG表達高于陰性對照組P005HSAMIR122組HBSAG表達低于ANTIMIR122組P001HSAMIR122組HBSAG表達低于LNAANTIMIR122組P005ANTIMIR122組HBSAG表達高于GFP組P005。④轉(zhuǎn)染48小時后HBEAG表達LNAANTIMIR122組HBEAG表達高于陰性對照組的表達P005HSAMIR122組HBEAG表達低于LNAANTIMIR122組P005GFP組HBEAG表達低于LNAANTIMIR122組P005。⑤實驗組各組細胞內(nèi)MIR122的表達LNAANTIMIR122組與ANTIMIR122組的MIR122含量相對于陰性對照組表達下調(diào)。HSAMIR122組的MIR122含量相對于陰性對照組表達上調(diào)。GFP組的MIR122含量相對于陰性對照組表達沒有差異。結(jié)論MIR122與HBSAG表達呈負相關(guān)MIR122被下調(diào)HBEAG表達增加。

簡介：點擊查看更多人乙肝病毒基因組多態(tài)性的生物信息學分析及意義.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：第一部分編碼人GIRK4基因的SHRNA序列篩選及腺病毒表達載體的構(gòu)建實驗一人GIRK4的SHRNA真核表達載體質(zhì)粒構(gòu)建目的構(gòu)建編碼人GIRK4的SHRNA真核表達載體質(zhì)粒，為利用基因沉默技術(shù)從轉(zhuǎn)錄后水平進行GIRK4的研究做準備。方法根據(jù)人GIRK4序列設(shè)計并合成四組SHRNA寡核苷酸片段，退火形成雙鏈并克隆進入載體PGCSIU6，并進行PCR鑒定和測序。結(jié)果PCR證明構(gòu)建的SHRNA已插入載體，經(jīng)測序證明與與設(shè)計的相同，獲得人GIRK4的SHRNA表達載體質(zhì)粒（PGCSIGIRK4SHRNAU6）。結(jié)論構(gòu)建的GIRK4的SHRNA真核表達載體可進入哺乳動物細胞內(nèi)表達短發(fā)夾RNA，經(jīng)DICER酶裂解成SIRNA并降解靶基因MRNA，而達到基因干擾的作用，為利用其進行GIRK4功能研究奠定了基礎(chǔ)。實驗二人GIRK4的真核表達載體質(zhì)粒構(gòu)建目的構(gòu)建編碼人GIRK4真核表達載體質(zhì)粒，為進行人GIRK4的SHRNA序列的篩選作準備。方法以購買的人GIRK4基因為模板，PCR其CDNA編碼序列并克隆進入載體PEGFP－C1，并進行PCR鑒定、測序及轉(zhuǎn)染293細胞在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果PCR證明CDNA已插入載體，經(jīng)測序證明與與設(shè)計的相同，獲得人GIRK4融合蛋白的表達載體質(zhì)粒（PEGFPGIRK4C1），并能轉(zhuǎn)染293細胞表達融合蛋白。結(jié)論構(gòu)建的人GIRK4真核表達載體可進入哺乳細胞內(nèi)表達GIRK4－EGFP融合蛋白，為進行針對GIRK4基因RNA干涉序列篩選打下基礎(chǔ)。實驗三人GIRK4基因RNA干涉序列的篩選目的RNA干擾是基因技術(shù)的重要進展，人們可以在轉(zhuǎn)錄后水平減少基因的表達。對RNAI是否有效而言，基因靶序列的選擇是至關(guān)重要的因素。我們研究了外源表達系統(tǒng)中（HEK293CELL）GIRK4SHRNA沉默GIRK4基因表達的有效性及選擇高效的干涉序列。方法將已構(gòu)建的四個靶向GIRK4基因的不同區(qū)域GIRK4的SHRNA表達載體質(zhì)粒（PGCSIGIRK4SHRNAU6）、對照質(zhì)粒分別與與人GIRK4的真核表達載體質(zhì)粒（PEGFPGIRK4C1）共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，收集轉(zhuǎn)染后48H的細胞，進行WESTERNBLOTTING檢測。結(jié)果轉(zhuǎn)染48小時之后，與對照組相比，四個不同序列的SHRNA表達載體質(zhì)粒（PGCSIGIRK4SHRNAU6）使GIRK4蛋白表達在48小時分別減少781％、853％、883％、943％，其中以4＃載體序列是最有效的干涉序列，其序列為GGCTGAGCAGAATGAAGAA。結(jié)論成功地在外源表達系統(tǒng)篩選出高效的針對人GIRK4基因的高效RNA干涉序列。實驗四重組腺病毒載體ADGIRK4SHRNA的構(gòu)建及鑒定目的利用ADMAX腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體ADGIRK4SHRNA并在293細胞中擴增制備重組腺病毒載體。方法人工合成針對GIRK4的4＃高效干涉序列將其克隆到PDC316EGFPU6載體中，將PDC316GIRK4SHRNAEGFPU6載體和骨架病毒PBHGLOX_E13CRE共轉(zhuǎn)染293細胞，包裝成重組的病毒顆粒，并進行PCR鑒定和測序。結(jié)果經(jīng)PCR鑒定和測序，證實成功地構(gòu)建了攜帶人GIRK4的4＃高效干涉序列重組腺病毒載體ADGIRK4SHRNA并制備出高滴度重組病毒。結(jié)論成功地構(gòu)建了攜帶人GIRK4SHRNA片段的重組腺病毒載體ADGIRK4SHRNA，為進一步進行GIRK4的研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分人心房肌細胞培養(yǎng)目的培養(yǎng)出一定數(shù)量和具有良好狀態(tài)的人心房肌細胞。方法聯(lián)合運用Ⅰ型膠原酶和ⅩⅣ型蛋白酶消化人右心耳的標本，并利用差速貼壁法消除大部分非心肌細胞，并利用ACTIN抗體進行免疫組化鑒定。結(jié)果成功培養(yǎng)出一定數(shù)量人心房肌細胞，經(jīng)ACTIN抗體鑒定90％以上均為心肌細胞。結(jié)論成功培養(yǎng)出人心房肌細胞，為今后進行下一步實驗打下了基礎(chǔ)。第三部分腺病毒介導(dǎo)的ADGIRK4SHRNA對人心房肌細胞GIRK4干涉的實驗研究目的和背景心房顫動是臨床上最常見的心律失常之一其與迷走神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)；心臟迷走神經(jīng)通過釋放的乙酰膽堿，作用于心房M2受體G蛋白IKACH通路，激活I(lǐng)KACH。GIRK4是IKACH的功能亞單位基因敲除的GIRK4小鼠不能誘發(fā)房顫。本實驗通過將腺病毒介導(dǎo)的GIRK4SHRNA導(dǎo)入人心房肌細胞，觀察在人心房肌細胞進行RNA干涉GIRK4的問題、可行性及對迷走神經(jīng)通路上的GIRK1、M2ACHR表達及IKACH電流密度的影響，為今后將RNA干涉技術(shù)引入心律失常機制的研究及基因治療提供新思路和初步經(jīng)驗。方法將重組腺病毒載體ADGIRK4SHRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人心房肌細胞，收集轉(zhuǎn)染后不同時間的細胞，利用RTPCR、蛋白印跡來檢測GIRK4、GIRK1、M2ACHR的表達及用全細胞膜片鉗技術(shù)來檢測IKACH、IK1電流密度的變化。結(jié)果ADGIRK4SHRNA在MOI20對人心房肌細胞轉(zhuǎn)染效率即達到95％以上；在MRNA水平和蛋白水平降低了GIRK4的表達，呈現(xiàn)出劑量依賴性和時間依賴性MOI為52050時，ADGIRK4SHRNA干涉效率分別為151％352％511％（P005），使IKACH的電流密度下降了53％（P結(jié)論ADGIRK4SHRNA在MRNA和蛋白水平降低了GIRK4的表達說明在人心房肌細胞進行RNA干涉GIRK4是可行的但存在許多需解決的問題；GIRK4的表達下降進而導(dǎo)致GIRK1、M2ACHR的表達的變化IKACH的電流密度下降，表明GIRK4在心房M2受體G蛋白IKACH通路和IKACH通道中處于一個重要的地位，干涉GIRK4的表達具有潛在的治療效應(yīng)。