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簡(jiǎn)介：第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明秉承學(xué)校嚴(yán)謹(jǐn)?shù)男ｏL(fēng)和科研作風(fēng)，本人申明所呈交的論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得我校或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料，與我同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名盈型日期2竺竺塑，曰第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本人完全了解第三軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬第三軍醫(yī)大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為第三軍醫(yī)大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。學(xué)校可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名日期

簡(jiǎn)介：分類號(hào)分類號(hào)R743學(xué)校代碼學(xué)校代碼10392學(xué)科專業(yè)代碼學(xué)科專業(yè)代碼100204學(xué)號(hào)200902009福建醫(yī)科大學(xué)博士研究生畢業(yè)論文慢病毒介導(dǎo)的慢病毒介導(dǎo)的NANOG基因?qū)χ車窠?jīng)損傷性神經(jīng)病基因?qū)χ車窠?jīng)損傷性神經(jīng)病理性疼痛模型脊髓突觸重塑的影響理性疼痛模型脊髓突觸重塑的影響EFFECTOFLENTIVIRALMEDIATEDNANOGGENETRANSFERONTHESPINALCORDSYNAPTICPLASTICITYINRATWITHPERIPHERALNERVEINJURY二○一二○一二年六月學(xué)位類型醫(yī)學(xué)博士醫(yī)學(xué)博士所在學(xué)院院第一臨床第一臨床醫(yī)學(xué)院學(xué)院研究生生周海濤周海濤學(xué)科學(xué)科、專業(yè)專業(yè)神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)病學(xué)導(dǎo)師師張志堅(jiān)張志堅(jiān)教授教授研究起止日期研究起止日期2010年2月至月至2012年2月答辯日期期2012年06月08日目錄英文縮略詞表英文縮略詞表1中文摘要中文摘要2ABSTRACT6前言前言11第1部分部分?jǐn)y帶攜帶NANOG基因慢病毒重組載體質(zhì)粒（基因慢病毒重組載體質(zhì)粒（PNLNANOGIRES2EGFP）的構(gòu)建及）的構(gòu)建及鑒定鑒定14材料與方法14結(jié)果22討論23第2部分部分?jǐn)y帶攜帶NANOG基因慢病毒載體的包裝、濃縮、滴度測(cè)定和鑒基因慢病毒載體的包裝、濃縮、滴度測(cè)定和鑒定25材料與方法25結(jié)果33討論36第3部分部分脂質(zhì)體介導(dǎo)的脂質(zhì)體介導(dǎo)的NANOG基因轉(zhuǎn)移抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反基因轉(zhuǎn)移抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的體外實(shí)應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)研究39材料與方法39結(jié)果42討論45第4部分部分慢病毒載體介導(dǎo)慢病毒載體介導(dǎo)的NANOG基因轉(zhuǎn)移對(duì)大鼠周圍神經(jīng)損傷性神經(jīng)病理性疼基因轉(zhuǎn)移對(duì)大鼠周圍神經(jīng)損傷性神經(jīng)病理性疼痛模型痛模型脊髓突觸重塑的影響脊髓突觸重塑的影響49材料與方法49結(jié)果53討論63結(jié)論結(jié)論67參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)68文獻(xiàn)綜述文獻(xiàn)綜述77致謝致謝85在校期間發(fā)表的論文在校期間發(fā)表的論文86附錄附錄87

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）冠狀病毒核衣殼蛋白和囊膜蛋白E的重組表達(dá)及其單克隆抗體制備.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：研究背景及目的乙型肝炎病毒HBV感染影響著全世界約354億人，其明顯增加疾病的發(fā)生率與死亡率，盡管已采取了相關(guān)公共衛(wèi)生措施干預(yù)，但目前仍是世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題1，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化、原發(fā)性肝癌（HCC）234。中國(guó)是乙型病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，慢性乙型肝炎（CHB）患者約2000萬(wàn)例5，抗病毒治療是治療慢性乙型肝炎CHB的主要方法核苷類似藥物是現(xiàn)階段主要的抗病毒治療藥物但目前藥物或治療方案遠(yuǎn)非理想，療效和耐藥成為目前慢性乙型肝炎抗病毒治療的主要問(wèn)題。HBV高病毒載量（HBV﹥107COPIESML與慢性乙型肝炎疾病的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，高病毒載量是肝硬化和肝細(xì)胞癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素678，肝硬化與肝細(xì)胞癌的發(fā)生率隨著HBVDNA的水平升高而上升，肝細(xì)胞癌患者的死亡率也隨著HBVDNA水平的升高而增加，同時(shí)HBV高病毒載量還表現(xiàn)出難治性有研究表明HBEAG陽(yáng)性的慢乙肝患者，HBVDNA研究方法選擇我院2012年1月2014年4月符合抗病毒治療的未曾使用核苷（酸）類似物的初治高病毒載量E抗原陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者60例，分為聯(lián)合組30例和單藥組30例，聯(lián)合組應(yīng)用拉米夫定100MGQD阿德福韋酯10MGQD，單藥組給予恩替卡韋05MGQD，治療觀察研究48周。分別在基線、12、24、48周時(shí)留取血清，采用全自動(dòng)分析生物化學(xué)儀檢測(cè)肝功能、腎功能、血生物化學(xué)指標(biāo)；采用化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)HBSAG和HBEAG采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBVDNA水平，采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)病毒耐藥基因。組間比較采用配對(duì)T檢驗(yàn)，率的比較采用卡方檢驗(yàn)。研究結(jié)果1聯(lián)合組24例，單藥組29例完成了48周隨訪。兩組治療前性別、年齡、血清ALT、HBVDNA、HBSAG水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。2兩組在治療48周時(shí)，HBVDNA＜500拷貝ML和HBVDNA＜300拷貝ML的比率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在HBVDNA＜100拷貝ML的比率，聯(lián)合組為3例（125％），單藥組為12例（4138），兩組比較P＜005，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3治療48周時(shí)，HBEAG轉(zhuǎn)陰率、ALT復(fù)常率、HBVDNA轉(zhuǎn)陰率分別為單藥組4483132986212529和5517（1629，聯(lián)合組250（6247501824和2917（724）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P值均大于005）。4治療48周時(shí)，出現(xiàn)病毒學(xué)突破的單藥組0例，聯(lián)合組2例（83），且均檢測(cè)到耐藥變異位點(diǎn)，兩組比較P＞005，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5治療48周時(shí)，兩組患者均未出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件，兩組患者出現(xiàn)不良反應(yīng)事件率比較P＞005，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)論本研究表明恩替卡韋單藥治療E抗原陽(yáng)性的高病毒載量慢乙肝患者的在抑制病毒作用上要優(yōu)于拉米夫定與阿德福韋酯聯(lián)合治療組，能更好的抑制病毒復(fù)制，且出現(xiàn)病毒學(xué)突破的情況也低于聯(lián)合治療組。兩組患者治療中均未出現(xiàn)與藥物相關(guān)的嚴(yán)重不良事件，兩種治療都具有較好的安全性。

簡(jiǎn)介：中山大學(xué)碩士學(xué)位論文印病毒DNA及阻病毒相關(guān)抗原抗體聯(lián)合診斷鼻咽癌的研究專業(yè)流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)研究生姜世強(qiáng)導(dǎo)師柳青教授答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)成員2007年5月廣州吃黝摘要本研究81例病例均來(lái)自中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院門(mén)診，經(jīng)病理確診的未經(jīng)治療的鼻咽癌病人，89例對(duì)照來(lái)自四會(huì)市篩查現(xiàn)場(chǎng)，經(jīng)初步檢查為健康人。分別檢測(cè)病例和對(duì)照EBVDNA、VCA／IGA、EA／IGA、EBNAL／IGA、EBNAL／IGG和ZTA／IGG。采用巢式熒光定量PCR檢測(cè)EBVDNA，采用免疫酶法檢測(cè)VCA／IGA和EA／IGA，采用ELISA法檢測(cè)EBNAL／IGA、EBNAI／IGG和ZTA／IGG。分別分析各指標(biāo)的靈敏度、特異度、約登指數(shù)以及預(yù)測(cè)價(jià)值。比較各指標(biāo)的R0C曲線下面積。采用聯(lián)合試驗(yàn)并聯(lián)或者串聯(lián)的方式聯(lián)合各指標(biāo)，比較各種聯(lián)合的診斷價(jià)值。利用這些指標(biāo)建立LOGISTIC回歸模型，以AIC為模型診斷的參數(shù)，并將預(yù)測(cè)概率作為診斷羿明癌的指標(biāo)，比較各種指標(biāo)組合綜合診斷鼻恫癌的診斷價(jià)值。模擬篩查人群，計(jì)算幾種選定方案的檢出率和假陽(yáng)性率以及平均花費(fèi)，比較幾種組合的診斷效果。采用SAS91軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用WILCOXON兩樣本檢驗(yàn)對(duì)病例組和對(duì)照組的DNA水平和抗體水平進(jìn)行比較。ROC曲線的繪制采用SAS軟件包中PROCLOGISTIC和PROCGPLOT過(guò)程步，曲線下面積的比較采用SAS宏程序％ROC完成。ROC曲線下面積采用非參數(shù)方法BAMBER，1975。部分圖形的繪制采用R軟件。多個(gè)指標(biāo)的聯(lián)合采用LOGISTIC回歸模型。結(jié)果1采用WILCOXON兩樣本檢驗(yàn)結(jié)果顯示各個(gè)指標(biāo)病例組與對(duì)照組差別均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同性別『日J(rèn)各個(gè)指標(biāo)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)分析結(jié)果顯示EBVDNA與VCA／IGA、EA／IGA有相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為03127，03350。VCA／IGA與EA／IGA的相關(guān)系數(shù)為08230。EBNAL／IGA與EBNAL／IGG的相關(guān)系數(shù)為04191。2單個(gè)指標(biāo)比較結(jié)果顯示VCA／IGA仍然具有最大的靈敏度9506％，CUTOFFL10，EBNAL／IGG具有最大的特異度9551％，CUTOFF1。ROC分析顯示EBNAL／IGA的曲線下面積最大，可能具有較大的診斷價(jià)值。EA／IGA的曲線下面積最小。3聯(lián)合試驗(yàn)結(jié)果顯示VCA／IGA與EA／IGA并聯(lián)仍然有較大的靈敏度和特異度。DNA與VCA／IGA、EA／IGA、EBNAL／IGA、EBNAL／IGG串聯(lián)時(shí)特異度均可達(dá)到LOO％。兒

簡(jiǎn)介：登革病毒DENGUEVIRUSES，DV是黃病毒屬FLAVIVIRUS的單股正鏈RNA病毒，根據(jù)E蛋白的抗原性不同，它分為四個(gè)血清型DV1，2，3，4。DV是登革熱DENGUEFEVER，DF和登革出血熱休克綜合癥DENGUEHEMRHAGICFEVERDENGUESHOCKSYNDROME，DHFDSS的病原體。前者為輕型發(fā)熱性疾病，而后者則是危及生命的急癥，病死率可達(dá)510％。DHFDSS的主要臨床表現(xiàn)是血管通透性增加引起的出血和休克，除免疫機(jī)制外，病毒顆粒本身可通過(guò)直接或間接途徑作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞VΜLARENDOTHELIALCELLS，VEC，影響其功能，進(jìn)而介導(dǎo)DHFDSS的發(fā)生。因此，了解DV與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制，對(duì)于闡明DV的致病機(jī)制，從中尋找防治DHFDSS的突破點(diǎn)，是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。病毒感染宿主細(xì)胞，必須經(jīng)過(guò)吸附、穿入脫殼、大分子生物合成及組裝、釋放這樣一個(gè)完整的復(fù)制周期，這一過(guò)程實(shí)際上是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的過(guò)程。為了有效的感染PRODUCTIVEINFECTION宿主細(xì)胞，病毒必須進(jìn)入宿主細(xì)胞、到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的特定區(qū)域才能啟動(dòng)并完成自我復(fù)制，通常DNA病毒需要進(jìn)入細(xì)胞核，而RNA病毒需到達(dá)細(xì)胞核周的區(qū)域。已知真核細(xì)胞中充滿了細(xì)胞器和細(xì)胞骨架，限制分子量大于500KDA分子的自由擴(kuò)散，若不借助細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，病毒顆粒難于通過(guò)粘滯的、半流體的細(xì)胞質(zhì)到達(dá)特定目的地。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是感染早期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，病毒可在細(xì)胞表面直接穿入胞漿膜進(jìn)入胞漿，或者通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入內(nèi)體或細(xì)胞器后再發(fā)生穿入，進(jìn)入胞漿。病毒和細(xì)胞的不同，病毒進(jìn)入細(xì)胞的方式和途徑也不同，病毒最后的命運(yùn)也不同。目前認(rèn)為，VEC既是DHFDSS病理過(guò)程的效應(yīng)細(xì)胞，也是DV在體內(nèi)增殖的靶細(xì)胞之一，因此，對(duì)DV進(jìn)入VEC機(jī)制的研究，有助于了解DV與VEC相互作用的分子機(jī)制和DV的致病機(jī)制。另外，為阻斷病毒的復(fù)制，采用多肽、蛋白和有機(jī)小分子等阻斷劑阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的策略，比病毒進(jìn)入細(xì)胞后再采取的其它阻斷策略要容易、簡(jiǎn)單和高效，因此研究病毒進(jìn)入VEC的過(guò)程和機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步設(shè)計(jì)抗病毒靶向藥物也具有重要意義。已知外源性大分子如細(xì)菌、病毒等進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要途徑有1網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑CLATHRINMEDIATEDENDOCYTOSIS網(wǎng)格蛋白CLATHRIN、表皮生長(zhǎng)因子受體激酶的底物15EPS15和接頭蛋白ADAPTERPROTEINS，AP是該途徑中不可缺少的關(guān)鍵分子；2細(xì)胞膜陷穴途徑CAVEOLAE陷穴蛋白1CAVEOLIN1在此途徑中發(fā)揮重要作用；3巨胞飲途徑MACROPINOCYTOSIS。為此，本實(shí)驗(yàn)以臍靜脈來(lái)源、能夠支持DV增殖的上皮樣細(xì)胞株ECV304細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)，探索了DV進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程和機(jī)制。首先，我們利用免疫熒光雙染色技術(shù)，觀察了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑和細(xì)胞膜陷穴途徑的關(guān)鍵分子EPS15、網(wǎng)格蛋白、接頭蛋白ΑADAPTINΑ、陷穴蛋白1在感染前后的分布變化，并分析了上述分子與DV2抗原的共存情況；然后，我們選用氯丙嗪CHLPROMAZINE、制霉素NYSTATIN和細(xì)胞松弛素DCYTOCHALASIND三種藥物分別作用細(xì)胞，以阻滯網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑、陷穴途徑和巨胞飲途徑，再進(jìn)行DV感染實(shí)驗(yàn)，通過(guò)噬斑計(jì)數(shù)法PLAQUEASSAY測(cè)定感染后不同時(shí)相點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度，比較三種途徑病毒進(jìn)入數(shù)量的不同；最后根據(jù)上述結(jié)果，利用RNAI，我們對(duì)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑在DV進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中的作用進(jìn)行深入研究。本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下1免疫熒光染色結(jié)果DV2感染后48小時(shí)，鏡下可見(jiàn)較多的DV抗原陽(yáng)性細(xì)胞，病毒抗原主要呈環(huán)狀分布于核周或呈團(tuán)塊狀堆積在核周一側(cè)；激光共聚焦顯微鏡下，在未感染的對(duì)照細(xì)胞中，網(wǎng)格蛋白、EPS15、接頭蛋白Α和陷穴蛋白1分別均勻的分布于胞漿中；與此不同的是，感染后在DV抗原陽(yáng)性細(xì)胞中，網(wǎng)格蛋白、EPS15和ADAPTINΑ主要分布在核周，且熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，網(wǎng)格蛋白、EPS15與DV2抗原有明顯的共存，ADAPTINΑ與DV2抗原有部分的共存；CAVEOLIN1的分布在感染后無(wú)明顯變化，且與DV2抗原共存不明顯。提示DV2進(jìn)入ECV304細(xì)胞與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑密切相關(guān)。2藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步證明上述結(jié)論，我們選用氯丙嗪、制霉素和細(xì)胞松弛素D三種藥物分別處理細(xì)胞，以阻滯網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑、細(xì)胞膜陷穴途徑和巨胞飲途徑，再進(jìn)行DV感染實(shí)驗(yàn)，通過(guò)噬斑計(jì)數(shù)法測(cè)定感染后0H、4H、8H、24H細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度，結(jié)果顯示與僅實(shí)施感染實(shí)驗(yàn)、未進(jìn)行藥物處理的對(duì)照組比較，三個(gè)藥物處理組的細(xì)胞內(nèi)病毒滴度，在感染后各時(shí)相點(diǎn)均呈現(xiàn)不同程度的下降，其中氯丙嗪處理組下降最為明顯，感染后0H、4H、8H、24H細(xì)胞內(nèi)病毒滴度分別下降了41％、29％、66％和44％；而細(xì)胞松弛素D和制霉素處理組僅有輕微下降，在感染后0H、4H、8H和24H，細(xì)胞松弛素D組細(xì)胞內(nèi)病毒滴度分別下降了13％、6％、14％和19％，制霉素組細(xì)胞內(nèi)病毒滴度分別比對(duì)照組下降了9％、7％、10％和16％。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明DV2可能通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑進(jìn)入ECV304細(xì)胞。3RNAI結(jié)果由于藥物處理對(duì)細(xì)胞的影響可能是多方面和非特異的，所得結(jié)果尚需其他證據(jù)的支持。我們采用RNAI技術(shù)，以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑的關(guān)鍵分子EPS15為靶分子，構(gòu)建了RNAI表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至ECV304細(xì)胞后經(jīng)篩選得到細(xì)胞克隆株ECV304EPS15；間接免疫熒光和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ECV304EPS15中EPS15的表達(dá)下降了76％，證實(shí)我們成功地干擾了EPS15在ECV304細(xì)胞中的表達(dá)；轉(zhuǎn)鐵蛋白是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑的細(xì)胞標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)證明ECV304EPS15能夠阻止轉(zhuǎn)鐵蛋白的進(jìn)入，說(shuō)明該克隆株的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑已被特異地阻斷。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們獲得了因EPS15功能缺陷導(dǎo)致網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞途徑被阻滯的ECV304細(xì)胞模型。利用上述細(xì)胞模型，我們實(shí)施了DV2感染實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了病毒感染后不同時(shí)相點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)外病毒滴度，結(jié)果顯示感染DV2后的0H、4H、8H、24H，ECV304EPS15細(xì)胞內(nèi)病毒滴度分別下降了73％、63％、59％和87％；與對(duì)照細(xì)胞ECV304N轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞株比較，差異非常顯著P＜001，感染后24H細(xì)胞外病毒滴度ECV304EPS15比ECV304N下降了74％。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明DV2通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑進(jìn)入ECV304細(xì)胞，而EPS15是DV2進(jìn)入ECV304細(xì)胞的必需分子。特別是感染后24H，細(xì)胞外病毒滴度的明顯降低，提示網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑不僅與DV的進(jìn)入有關(guān)，可能參與了病毒復(fù)制、細(xì)胞間擴(kuò)散及釋放等多個(gè)環(huán)節(jié)，當(dāng)然這一結(jié)論有待于進(jìn)一步完善。

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簡(jiǎn)介：本研究目的是為了考察清熱合劑對(duì)呼吸道合胞病毒RSV、腺病毒Ⅲ型ADV3、流感病毒A3、A1及B型的抑制作用；建立測(cè)定血漿中黃芩苷的高效液相色譜法，以研究清熱合劑吸收入血活性成分，旨在為清熱合劑作為新藥開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法為細(xì)胞培養(yǎng)法體外抗病毒采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以雙黃連為陽(yáng)性對(duì)照藥，觀察清熱合劑在非洲綠猴腎細(xì)胞VERO和咽喉癌上皮細(xì)胞HEP2中對(duì)RSV、ADV3的抑制作用及清熱合劑在狗腎傳代細(xì)胞MDCK中對(duì)流感病毒A3、A1及B型的抑制作用。雞胚培養(yǎng)法體外抗病毒采用雞胚實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)，以流感病毒血凝滴度為指標(biāo)觀察大鼠含藥血清對(duì)流感病毒A3型抑制作用。研究結(jié)果表明，清熱合劑在VERO和HEP2細(xì)胞中對(duì)RSV、ADV3有明顯抑制作用，在MDCK細(xì)胞中對(duì)流感病毒A3、A1型無(wú)抑制作用，對(duì)流感病毒B型有一定的抑制作用；在雞胚中對(duì)流感病毒A3有顯著抑制作用；RPHPLC法簡(jiǎn)便快速，適用于黃芩苷的血藥濃度測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究。清熱合劑中黃芩苷在大鼠體內(nèi)出現(xiàn)多峰現(xiàn)象，并表明很可能是該方中抗病毒的活性成分之一。

簡(jiǎn)介：目的研究腺病毒介導(dǎo)的人低氧誘導(dǎo)因子1ΑHYPOXIAINDTJCIBLEFACTLΑ，HIF1Α基因在急性心梗模型中能否被有效轉(zhuǎn)染，心肌細(xì)胞凋亡變化以及HIF1Α的上下游基因細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶EXTRACELLULARSIGNAIREGULATEDKINASE，ERK、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶PERK，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VULARENDOTHELIALGROWTHFACT，VEGF在長(zhǎng)期缺血心肌中的表達(dá)，以此為基礎(chǔ)探討腺病毒介導(dǎo)HIF1Α轉(zhuǎn)基因治療在心肌缺血中可能的分子機(jī)制及其發(fā)揮作用的時(shí)間窗，并以HIF1Α核酶基因進(jìn)行干預(yù)從而證明HIF1Α在缺血心肌保護(hù)中發(fā)揮重要作用。方法普通級(jí)成年健康新西蘭白兔120只，體重225KG，雌雄不拘，隨機(jī)分為4組，每組30只。①假手術(shù)組SHAM組開(kāi)胸后，只穿線不結(jié)扎。②不含HIFLΑ腺病毒載體轉(zhuǎn)染組ADBLANK組結(jié)扎后心肌內(nèi)注射不含目的基因的病毒顆粒溶液8ΜI。⑧含HIF1Α腺病毒載體轉(zhuǎn)染組ADHIFLΑ組結(jié)扎后心肌內(nèi)注射含目的基因的病毒顆粒溶液8ULADHIFLΑ滴度為110PFU／M1。④腺病毒介導(dǎo)的HIF1Α核酶基因干預(yù)組RZHIFLΑ組結(jié)扎后心肌內(nèi)注射HIF1Α核酶基因8ΜLRZHIF1Α滴度為110PFU／M1。模型制備成功后常規(guī)飼養(yǎng)，于L、7、14、28、56天分別取材分為5個(gè)亞組，每組6只。動(dòng)物取材時(shí)經(jīng)左心室心尖部插管，連接于MACLAB／8S多功能生理儀，監(jiān)測(cè)左心室功能。各組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，麻醉后取樣，SHAM組取左冠狀動(dòng)脈前降支支配末梢部位心肌，其余各組取左心室梗死邊緣缺血區(qū)心肌組織，分別于液氮中保存和4％戊二醛、10％福爾馬林中固定，用RTPCR方法檢測(cè)HIF1Α和VEGF的MRNA表達(dá)，末端原位標(biāo)記TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。對(duì)于56天長(zhǎng)期缺血的各組心肌，透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化，免疫組化方法觀察HIFLΑ及其上游ERK、PERK，下游VEGF蛋白的定位情況。免疫印跡WESTERNBLOT法定量檢測(cè)HIF1Α、ERK、PERK、VEGF蛋白表達(dá)情況。結(jié)果L、HE染色的光鏡及電鏡結(jié)果證實(shí)載體注射、取材部位是心肌梗死邊緣缺血心肌。2、RTPCR結(jié)果顯示，術(shù)后L天、7天、14天、28天均有外源性HIF1ΑMRNA的表達(dá)，56天時(shí)已基本無(wú)表達(dá)，其中7天時(shí)HIF1ΑMRNA表達(dá)較L天、14天、28天明顯增多P005。4、血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示SHAAM組LVDP、±DP／DT最高，RZHIF1Α組最低。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)其他各組LVDP、±DP／DT較SHAM組明顯下降P005，PERK無(wú)表達(dá)；VEGF蛋白的表達(dá)ADHIF1A組、ADBLANK組、RZHIFLA組較SHAM組有顯著性差異P005。結(jié)論1、腺病毒介導(dǎo)人HIF1A基因轉(zhuǎn)染入缺血心肌后，RNA水平檢測(cè)到外源HIF1A基因及其下游基因VEGF的表達(dá)，目的基因被有效轉(zhuǎn)錄并激活。2、HIFLA基因有效轉(zhuǎn)染后能夠明顯減少心肌細(xì)胞的凋亡，改善心功能參數(shù)，并且未觀察到不良反應(yīng)。3、腺病毒介導(dǎo)人HIFLA基因?qū)﹂L(zhǎng)期缺血心肌無(wú)持續(xù)作用，其發(fā)揮作用的時(shí)間窗為心肌缺血急性期至亞急性期。4、腺病毒介導(dǎo)的HIFLA核酶基因抑制HIFLA及其下游基因的表達(dá)，使心功能惡化，證實(shí)了HIF1A的保護(hù)作用。

簡(jiǎn)介：Y956580蠶。鑭戈誓碩士學(xué)位論文2006屆鼠ING4基因腺病毒表連載體的構(gòu)建及抗腫瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究THEEXPERIMENTALSTUDYONRECOMBINANTEXPRESSIONANDANTITUMOREFFECTOFING4研究生姓名至盎越指導(dǎo)教師姓名舅島叢量揚(yáng)盜直一專業(yè)名稱盅蕉塋研究方向塑』G墨墅生論文提交日期生迦生生立且一THEEXPERIMENTALSTUDYONRECOMBINANTEXPRESSIONANDANTITUMOREFFECTOFMLNG4ABSTRACTOBJECTIVETOCONSTRUCTTHERECOMBINEDADENOVINESVECTOROFRUING4ANDEXPLORETHEEFFECTOFING4ONMSMMC7721CELLSMETHODSTHEPADTRACKCMVMLNG4WASCONSTRUCTEDWI廿1PCDAN30一MLNG4RECOMBINEDPLASMIDBYPCRASTEMPLATE，ENZYMEDIGESTIONANDLIGATIONTHEPADTRACKCMVMLNG4LINEAREDBYPMELWASCOTRANSDUCTEDINTOBJ5183WITHPADEASYIANALYSISOFPCRANDDNASEQUENCINGWASCARRIEDOUTTODEMONS仃ATETHESEQUENCEOFTHEPLASMIDTHEPADEASY1一PADTRACKCMVMLNG4RECOMBINEDADENOVIRUSVECTORWASLEAREDWITLLPACIANDTHENTRANSFECTEDINTOQBI一293ACELLSTHEMLNG4RECOMBINEDADENOVIMSWASOBTAINEDANDWASUSEDTOINFECTS刪C7721CELLSIDENTIFICATIONOFMLNG4MRNABYRTPCRWASCARRIEDOUTTODEMONSTRATETHEEXPRESSIONOFMLNG4INSMMC7721CELLSTHEEFFECTOFRUING4ONSMMC7721WASSTUDIEDBYMRTFLOWCYTOMETRYANDWESTEMBLOTRESULTSANALYSISBYRESTRICTINGENZYMEDIGESTIONANDPCROFPADTRACKCMVMING4RECOMBIANTPLASMIDSHOWEDRESULTSWEREABOUT750BP，DNASEQUENCINGREVEALEDTHATMING4CLONINGWERESUCCESSFULCELLCYCLEANDAPOPTOSISWEREEXAMINEDBYFLOWCYTOMETRYAFTERINFECTIONOFSMMC7721CELLSWITHPADEASY一1一PADTRACKCMVMLNG4ADMLNG4THEINHIBITIONOFMLNG4ONGROWTHOFSMMC7721CELLSWASTESTEDBYMTTWEFOUNDTHATMLNG4COULDINHIBITTHEGROWTHANDENHANCEAPOPTOSISI11SMMC7721CELLSII

簡(jiǎn)介：研究背景及意義支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道疾病，以氣道慢性炎癥、粘液分泌增加、氣道反應(yīng)性增高及氣道重塑為主要特征。哮喘的發(fā)生與發(fā)展受多種因素的調(diào)控，從而決定了淋巴細(xì)胞分化，免疫反應(yīng)類型，細(xì)胞因子合成及組織修復(fù)過(guò)程。盡管哮喘基礎(chǔ)研究取得較大的進(jìn)步，但目前臨床上對(duì)于哮喘的急性加重以及重癥哮喘的治療仍然不是很滿意。隨著分子病毒學(xué)技術(shù)的發(fā)展和RTPCR技術(shù)在臨床研究中的應(yīng)用，呼吸道病毒感染作為哮喘加重的最重要原因已被廣泛認(rèn)識(shí)。已經(jīng)證實(shí)，病毒誘發(fā)的哮喘加重在學(xué)齡兒童中的比例約為80?，而在成人中約為60U。呼吸道合胞病毒（RESPIRATYSYNCYTIALVIRUS，RSV）作為呼吸道單鏈RNA病毒的一種，是引起小兒呼吸道感染的最常見(jiàn)病原體，也是誘發(fā)嬰幼兒哮喘的主要原因，在哮喘的發(fā)展和加重中被認(rèn)為是一個(gè)重要的危險(xiǎn)因子。而且，針對(duì)RSV的免疫是不完全的和暫時(shí)的，所以已經(jīng)感染過(guò)RSV的成人可以再次被同株的RSV感染。微生物感染對(duì)機(jī)體的破壞作用導(dǎo)致宿主防御機(jī)制的進(jìn)化。在哺乳動(dòng)物，有兩套防御機(jī)制固有免疫和繼發(fā)性免疫。固有免疫識(shí)別是通過(guò)模式識(shí)別受體（PATTERNRECOGNITIONRECEPTS，PRRS）來(lái)完成的，每個(gè)受體都對(duì)微生物的保守和不變的特征識(shí)別具有廣泛的特殊性。PRRS識(shí)別微生物是通過(guò)與病原體相關(guān)分子模式（PATHOGENASSOCIATEDMOLECULARPATTERNS，PAMPS）的結(jié)合來(lái)完成的。在PRRS的病毒識(shí)別中，最具特征性的是TOLL樣受體（TOLLLIKERECEPTS，TLRS）。呼吸道上皮細(xì)胞除了作為物理屏障，也能通過(guò)感受外界刺激因素啟動(dòng)固有免疫反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而影響繼發(fā)性免疫反應(yīng)。在針對(duì)吸入性外來(lái)變應(yīng)原和病原體的繼發(fā)性免疫反應(yīng)的起始中，局部浸潤(rùn)的樹(shù)突狀細(xì)胞（DENDRITICCELLS，DCS）起到關(guān)鍵性作用。氣道上皮細(xì)胞影響DCS可以通過(guò)DCS激活因子胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（THYMICSTROMALLYMPHOPOIETIN，TSLP）的產(chǎn)生來(lái)調(diào)控TH細(xì)胞的局部分化。研究證實(shí)TSLP能誘導(dǎo)DCS調(diào)節(jié)初始CD4T淋巴細(xì)胞向TH2細(xì)胞分化，產(chǎn)生IL4、IL5、IL13和TNFΑ等細(xì)胞因子。在對(duì)氣道上皮細(xì)胞生成TSLP的刺激因子的研究中發(fā)現(xiàn)，TLR3的配體雙鏈RNA（DSRNA）與TLR3受體結(jié)合產(chǎn)生大量的TSLPMRNA。這提示病毒在呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程中形成的DSRNA中間體，可能通過(guò)TSLP的誘導(dǎo)，加重TH2炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步加重哮喘患者氣道粘膜炎癥。這個(gè)推論可以解釋為什么呼吸道病毒感染加重變態(tài)反應(yīng)性炎癥，而從免疫學(xué)理論上講，病毒誘導(dǎo)的TH1免疫反應(yīng)能拮抗TH2調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)。本項(xiàng)研究主要通過(guò)研究RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞16HBE分析固有免疫反應(yīng)受體TLR3的表達(dá)情況及對(duì)TSLP生成的影響，通過(guò)TLR3抗體阻斷的方法研究是否可以引起TSLP的生成的改變，通過(guò)模擬氣道局部TH1和TH2內(nèi)環(huán)境加入IFNΓ和IL4觀察其對(duì)RSV感染誘發(fā)的TSLP生成影響，同時(shí)觀察利巴韋林和地塞米松等藥物干預(yù)對(duì)支氣管上皮細(xì)胞生成TSLP的影響。為明確TSLP在哮喘動(dòng)物體內(nèi)的變化與哮喘的關(guān)系，通過(guò)RSV感染小鼠哮喘加重模型進(jìn)一步分析在RSV感染情況下小鼠氣道局部TSLP的表達(dá)與小鼠肺部炎癥的相互關(guān)系，并觀察不同藥物治療對(duì)RSV感染哮喘加重小鼠氣道TSLP生成和肺部炎癥的影響。方法一、體外細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)。1不同濃度和不同時(shí)間人工合成DSRNA聚肌胞（POLYIC）對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞16HBE表達(dá)TSLPMRNA和TLR3MRNA的影響。分別加入含0ΜGML、1ΜGML、5ΜGML、10ΜGML、25ΜGML、50ΜGML聚肌胞的10DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，刺激3小時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢測(cè)TSLPMRNA和TLR3MRNA相對(duì)表達(dá)量。10ΜGML聚肌胞加入10DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，分別刺激1H、2H、3H、6H、12H、24H，實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢測(cè)TSLPMRNA和TLR3MRNA相對(duì)表達(dá)量。2RSV病毒感染對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞16HBE固有免疫受體TLR3表達(dá)的影響。RSV病毒感染HEP2細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增；RSV在HEP2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)擴(kuò)增的間接免疫熒光鑒定；REEDMUENCH法測(cè)算RSV細(xì)胞毒力。RSV感染人支氣管上皮細(xì)胞16HBE24小時(shí)，間接免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞TLR3受體表達(dá)變化。3RSV病毒感染及干預(yù)因素對(duì)16HBE細(xì)胞TSLPMRNA和TLR3MRNA表達(dá)水平和TSLP蛋白表達(dá)的影響。試驗(yàn)分6組對(duì)照組，RSV組，RSVANTITLR3組，RSVIFNΓ組，RSVIL4組，RSV地塞米松組；RSV感染6小時(shí)后實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢測(cè)細(xì)胞TSLPMRNA和TLR3MRNA相對(duì)表達(dá)量；RSV感染24小時(shí)后WESTERNBLOTTING檢測(cè)各組細(xì)胞TSLP蛋白表達(dá)水平。4利巴韋林抑制RSV病毒感染對(duì)16HBE細(xì)胞TSLPMRNA表達(dá)水平和TSLP蛋白表達(dá)的影響。試驗(yàn)分4組對(duì)照組，RSV組，RSV利巴韋林組，利巴韋林組；RSV感染6小時(shí)后實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢測(cè)細(xì)胞TSLPMRNA相對(duì)表達(dá)量；RSV感染24小時(shí)后WESTERNBLOTTING檢測(cè)各組細(xì)胞TSLP蛋白表達(dá)水平。二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。1RSV病毒感染對(duì)哮喘加重小鼠氣道TSLP分泌和肺部炎癥的影響32只BALBC小鼠分為4組A組（對(duì)照組），B組（OVA組），C組（RSV組），D組（OVARSV模型組）。無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)小鼠氣道反應(yīng)性不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)，BUXCO無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)PENH值。小鼠血清ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子小鼠血清用于IL4、IFNΓ、IL5、IL13細(xì)胞因子檢測(cè)。小鼠氣管灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和ELISA檢測(cè)TSLP聚乙烯導(dǎo)管行小鼠氣管插管，PBS灌洗，灌洗液上清ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子TSLP；灌洗液離心沉淀細(xì)胞計(jì)數(shù)，瑞氏吉姆薩染色細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。小鼠肺臟組織病理觀察蘇木素伊紅（HE）染色觀察小鼠肺臟病理變化；碘酸雪夫（PAS）染色觀察氣道上皮細(xì)胞粘液合成。小鼠肺臟組織免疫組化觀察氣道上皮細(xì)胞TSLP表達(dá)，DAB顯色，陽(yáng)性顯示棕黃色。小鼠肺臟組織TSLP蛋白WESTERNBLOTTING檢測(cè)，GELPROANALYZER45軟件分析TSLP的相對(duì)表達(dá)量。2不同藥物治療對(duì)RSV感染哮喘加重小鼠TSLP分泌和肺部炎癥的作用32只BALBC小鼠分為4組對(duì)照組（OVARSV組），聚肌胞組（OVARSVPOLYIC組），利巴韋林組（OVARSVRIB組），地塞米松組（OVARSVDEX組）。無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)小鼠氣道反應(yīng)性；小鼠血清ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子血清IL4、IFNΓ、IL5、IL13濃度；小鼠氣管灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和ELISA檢測(cè)氣管灌洗液TSLP濃度；小鼠肺臟組織病理觀察；小鼠肺臟組織免疫組化觀察TSLP表達(dá)；小鼠肺臟組織TSLP蛋白WESTERNBLOTTING檢測(cè)。（方法同上）。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用SPSS130軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。各組間多重比較采用單向方差分析（ONEWAYANOVA），方差齊性時(shí)采用LSD法和SNK法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用DUNTST3法檢驗(yàn)。以P005為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論1DSRNA可以激活人支氣管上皮細(xì)胞16HBE固有免疫受體TLR3，促進(jìn)TSLPMRNA表達(dá)量增加。2RSV感染后病毒復(fù)制促進(jìn)固有免疫受體TLR3在人支氣管上皮細(xì)胞16HBE內(nèi)的表達(dá)。3RSV感染促進(jìn)16HBE細(xì)胞表達(dá)TSLP；IFN?？善鸬揭种谱饔?，IL4則起到協(xié)同作用促進(jìn)TSLP表達(dá)，表明不同TH1TH2微環(huán)境對(duì)TSLP的表達(dá)有不同影響；TLR3受體阻斷可以適度抑制TSLP表達(dá)，間接表明固有免疫受體TLR3在RSV感染的TSLP表達(dá)中起到一定作用；地塞米松可以顯著降低RSV感染引起的TSLP表達(dá)，說(shuō)明糖皮質(zhì)激素在RSV感染引起的TSLP表達(dá)中起到抑制作用。4利巴韋林抗病毒治療可以有效抑制16HBE細(xì)胞表達(dá)TSLP，說(shuō)明抑制RSV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制可以起到減少細(xì)胞表達(dá)TSLP的作用。5RSV感染可以促進(jìn)OVA過(guò)敏性哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞生成TSLP增加，并加重肺部炎癥反應(yīng)。6聚肌胞、利巴韋林和地塞米松藥物治療在一定程度上可以抑制RSV感染哮喘加重小鼠氣道上皮細(xì)胞生成TSLP的增加，減輕小鼠肺部炎癥反應(yīng)，其中以地塞米松的相對(duì)作用最強(qiáng)。

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簡(jiǎn)介：乙型肝炎病毒HBV基因組全長(zhǎng)僅為3200個(gè)堿基，包括4個(gè)相互重疊的讀框前CC基因、P基因、S基因和X基因。依據(jù)核苷酸序列異質(zhì)性≥8％可將HBV毒株分成不同的基因型。到目前為止一共發(fā)現(xiàn)了8個(gè)HBV基因型基因型A、B、C、D、E、F、G和H。E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地帶且與基因型D有類似的基因特征，異質(zhì)性最為明顯的F型主要分布于南美及中美洲。HBV幾個(gè)主要的基因型中均發(fā)現(xiàn)基因亞型現(xiàn)象的存在。其中基因型A可分為A1A33個(gè)亞型；基因型B可分為B1B44個(gè)亞型；基因型C可分為C1C44個(gè)亞型；基因型D分為D1D44個(gè)亞型；基因型F可分為F1、F2兩個(gè)亞型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBVC1、HBVC2是中國(guó)地區(qū)最普遍的HBVC亞型，其中是HBVC1占71％393512，HBVC2占27％112512此外，在對(duì)全國(guó)血清樣本進(jìn)行基因分型的過(guò)程中，我們?nèi)我膺x取PCRRFLP分型鑒定的基因型B、C、D樣本各3份進(jìn)行了全序列的測(cè)定以判斷該分型方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以PCRRFLP分型鑒定為基因型D的部分樣本測(cè)序后比較證實(shí)為基因型C，后來(lái)的研究顯示該種毒株在S區(qū)與基因型D相同，暫時(shí)命名為HBVCD重組體。并根據(jù)其序列特征建立了該重組體的初步篩選方法。以初步篩選方法對(duì)來(lái)自甘肅的HBV血清樣本進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了7例該種重組體；選取其中部分樣本進(jìn)行HBV全基因序列的測(cè)定，測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組的存在。這種亞型均為HBV基因型C與基因D毒株的重組體。因此，在中國(guó)大陸地區(qū)至少存在3種HBVC基因亞型HBVC1、HBVC2、及HBVCD。如同基因型呈地域性分布的特點(diǎn)一樣，基因型C亞型在我國(guó)不同地區(qū)的分布也有很大差異。在北方地區(qū)，98％以上基因型C毒株均屬于C2亞型，C1亞型罕見(jiàn)；而在南方地區(qū)，55％基因型C毒株為C1亞型，C2占較小比例。HBVC1亞型與C2亞型在各省的分布情況為北京2％154與98％5354；山東1％1100與99％99100；云南13％538與87％3338；湖南19％316與81％1316；廣東63％4775與37％2875；海南79％5367與21％1467。在東南地區(qū)的福建省，C1與C2的亞型的比例分別為1％172與99％7172。在中國(guó)西部HBV慢性感染人群中，基因型C亞型的情況與其它地區(qū)不同。在甘肅地區(qū)，C亞型的分布比例C1為1％190，C2為91％8290，CD重組體為8％790。本研究中還比較了兩種主要C基因亞型C1與C2感染者之間的臨床差異。人口學(xué)資料比較發(fā)現(xiàn)，C1亞型感染者年齡較C2亞型感染者小316±124VS344±120，P003。盡管C1亞型感染者較C2亞型感染者有較高的HBEAG陽(yáng)性率，兩者之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組病例在性別比率、肝功能檢查ALT水平及總膽紅素水平及臨床診斷方面未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，HBV基因亞型存在的現(xiàn)象對(duì)于疾病發(fā)生發(fā)展的影響尚有待進(jìn)一步研究。在本研究的第二部分，為研究HBV基因型功能學(xué)的差異，使用了腺病毒載體將目的HBV基因?qū)胝婧思?xì)胞，對(duì)不同HBV基因型毒株的表達(dá)與復(fù)制進(jìn)行了比較研究。腺病毒ADENOVIRUS，AD分布廣泛，在許多哺乳動(dòng)物和禽類中都發(fā)現(xiàn)其存在。其中人的腺病毒有50種以上，但通常都較溫和，很少危及生命。腺病毒對(duì)于研究真核細(xì)胞DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，RNA剪接加工，蛋白質(zhì)的合成以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化做出過(guò)重要的貢獻(xiàn)。腺病毒還具有高滴度、高穩(wěn)定性、高轉(zhuǎn)染效率、非致癌性等特點(diǎn)。此外，對(duì)野生型腺病毒進(jìn)行基因工程改造而制作的重組病毒載體系統(tǒng)，作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體、重組疫苗和基因治療載體也得到了廣泛應(yīng)用。本研究運(yùn)用了一種新的重組病毒構(gòu)建方法ADEASYTM系統(tǒng)，在體外模型中研究不同基因型HBV病毒復(fù)制活性差異。首先，我們構(gòu)建了13拷貝HBVB、HBVC全基因組，在其5’末端包含增強(qiáng)子Ⅰ及增強(qiáng)子Ⅱ，復(fù)制起點(diǎn)，X及前C啟動(dòng)子基因，前基因RNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，特異多腺苷酸化位點(diǎn)以及完整的X開(kāi)放讀框。這種結(jié)構(gòu)已被證明能在肝臟細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行有效的復(fù)制。隨后，將13拷貝HBV全基因插入到重組病毒穿梭載體PADTRACK的多克隆位點(diǎn)中，該位點(diǎn)位于CMV啟動(dòng)子及綠色熒光蛋白GFP位點(diǎn)上游，利用該系統(tǒng)，一方面可通過(guò)表達(dá)的GFP在熒光顯微鏡下觀察重組病毒感染情況，另一方面，構(gòu)建的13拷貝HBV全基因能夠利用病毒自身的調(diào)控序列啟動(dòng)HBV的復(fù)制，避免了載體上的外源啟動(dòng)子對(duì)HBV復(fù)制及表達(dá)的影響。將重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架載體PADEASY1共轉(zhuǎn)化ECOLIBJ5183細(xì)菌使之內(nèi)重組。在細(xì)菌中發(fā)生同源重組后，選出重組質(zhì)粒并酶切鑒定，將鑒定出的重組質(zhì)粒經(jīng)PACⅠ線性化后使用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)GFP可以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率和病毒的產(chǎn)生。得到重組腺病毒之后，進(jìn)行純化和擴(kuò)增，再使用兩種不同基因型HBV重組腺病毒感染HEPG2細(xì)胞。使用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG的表達(dá)情況，用美國(guó)雅培公司的化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀對(duì)細(xì)胞及培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行定量分析；熒光定量法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)上清中HBV的滴度；免疫組化檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBSAG及HBCAG的表達(dá)情況。結(jié)果表明，從我國(guó)慢性乙肝病毒感染者血清中獲得的HBV基因型B和C毒株，并經(jīng)過(guò)全序列的測(cè)定確定其基因型。通過(guò)酶切與連接成功構(gòu)建了兩種基因型的13拷貝HBVDNA，克隆篩選后進(jìn)行序列測(cè)定，證實(shí)了兩種基因型13拷貝HBVDNA序列正確無(wú)誤。為確保所構(gòu)建的有復(fù)制能力的13拷貝HBVDNA在病毒復(fù)制過(guò)程中不受這些重要位點(diǎn)的影響，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)核對(duì)，并與多株參考序列進(jìn)行比對(duì)，排除了有插入、缺失及重要位點(diǎn)突變的克隆。13拷貝HBVDNA序列經(jīng)雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收后，與腺病毒穿梭載體PADTRACK進(jìn)行連接，連接物轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌，隨機(jī)挑取克隆，雙酶切法初步驗(yàn)證插入序列片段大小的正確性。重組穿梭載體再用YS1YS2進(jìn)PCR擴(kuò)增后，NDEⅠ內(nèi)切酶消化，驗(yàn)證插入序列基因型的正確性。兩種基因型的重組穿梭載體分別被命名為ADTRACKHBVB和ADTRACKHBVC；轉(zhuǎn)化感染受態(tài)細(xì)菌ADEASIER1感受態(tài)細(xì)胞得到兩種基因型的腺病毒重組體PADEASIERB和PADEASIERC，PACⅠ酶切鑒定其正確性。大量提取的重組腺病毒質(zhì)粒PADEASIERB和PADEASIERC用PACⅠ酶切線性化后，用脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞轉(zhuǎn)染710天后，即可在熒光顯微鏡下看見(jiàn)明顯的GFP熒光，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光斑點(diǎn)數(shù)也隨之增多，在普通顯微鏡下可見(jiàn)明顯的病毒蝕斑，293細(xì)胞也出現(xiàn)固縮、變圓、脫落、裂解等明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象，結(jié)果證明了重組病毒的形成和擴(kuò)增。收獲轉(zhuǎn)染10天后的293細(xì)胞及上清液，反復(fù)凍融裂解后，再重新感染293細(xì)胞。感染2天后細(xì)胞即可看到GFP的表達(dá)，細(xì)胞也出現(xiàn)變圓、脫落、裂解等明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象。收獲二次感染的細(xì)胞及上清液，反復(fù)凍融裂解后，取上清再次感染293細(xì)胞，進(jìn)行病毒的大量擴(kuò)增，使兩種基因型的重組腺病毒滴度約為109ML。研究表明，兩種重組病毒的包裝是成功的，并且均具有很高的滴度，能夠有效的感染293細(xì)胞，并有很強(qiáng)的GFP表達(dá)。按感染復(fù)數(shù)為5的標(biāo)準(zhǔn)，兩種基因型的腺病毒重組體分別感染HEPG2細(xì)胞。當(dāng)感染細(xì)胞培養(yǎng)至第5天時(shí)收集感染細(xì)胞及上清，細(xì)胞內(nèi)HBCAG及HBSAG經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，均有蛋白表達(dá)。細(xì)胞及上清中的HBEAG和HBSAG用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可明確檢測(cè)到HBEAG及HBSAG的表達(dá)；上清及細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒經(jīng)定量檢測(cè)后有明確的上升，說(shuō)明我們所構(gòu)建的13拷貝HBVDNA能夠在HEPG2細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)和復(fù)制。分別用兩種不同HBV基因型的重組腺病毒感染HEPG2細(xì)胞，以后隔日收集感染細(xì)胞及清，并分別對(duì)上清中的病毒顆粒、HBEAG及HBSAG進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。感染第2天時(shí)，上清中即可檢測(cè)到病毒顆粒、HBEAG及HBSAG。感染第4天時(shí)上清中HBEAG及HBSAG的表達(dá)量最高，以后隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HBEAG及HBSAG的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，HBEAG及HBSAG的表達(dá)量C基因型明顯高于B基因型。上清中病毒顆粒的量在第2天時(shí)即達(dá)最高值，然后隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢下降趨勢(shì)，但兩種基因型間病毒定量無(wú)差別。在本研究中，我們證明了腺病毒載體能夠?qū)⒕哂袕?fù)制能力的HBV基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝細(xì)胞系，并能啟動(dòng)HBV復(fù)制導(dǎo)致完整的具有感染能力的HBV顆粒的產(chǎn)生，這說(shuō)明導(dǎo)入的HBVDNA能在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中復(fù)制。腺病毒介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)染成功將為我們進(jìn)一步研究病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力，比較不同的病毒株復(fù)制能力的差異，以及各病毒蛋白在病毒生活周期中的作用提供新的可靠途徑。本研究利用新型腺病毒系統(tǒng)在HBV基因型體外功能學(xué)研究方面的進(jìn)行了初步嘗試。研究結(jié)果證明，腺病毒系統(tǒng)能作為HBV體外功能學(xué)研究和毒株之間比較研究的非常有效的工具。研究的初步結(jié)果顯示，B基因型和C基因型在體外復(fù)制過(guò)程中其抗原表達(dá)有差異，基因型C明顯高于基因型B，但病毒復(fù)制水平未見(jiàn)明顯差異。由于本研究只是比較了兩種基因型之間單一毒株的差異，這種初步結(jié)果有待進(jìn)一步更深入的研究加以證實(shí)。

簡(jiǎn)介：研究背景臨床營(yíng)養(yǎng)支持是二十一世紀(jì)醫(yī)學(xué)發(fā)展的重大進(jìn)展之一，已成為現(xiàn)代醫(yī)療工作的重要組成部分。合理膳食和營(yíng)養(yǎng)素的攝入對(duì)疾病的預(yù)防、治療以及康復(fù)有著密切的關(guān)系。護(hù)士，做為健康照顧的主要提供者，在觀察病情、識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)和改善病人營(yíng)養(yǎng)方面起著十分重要的作用。研究目的了解太原市三級(jí)甲等綜合性醫(yī)院內(nèi)外科系統(tǒng)護(hù)士營(yíng)養(yǎng)知信行認(rèn)知現(xiàn)況，分析影響臨床護(hù)士營(yíng)養(yǎng)知信行認(rèn)知的主要因素，提出合理化建議。研究方法本研究采用問(wèn)卷調(diào)查法，調(diào)查表有引用問(wèn)卷和自編問(wèn)卷兩部分組成。引用問(wèn)卷為2006年美國(guó)JUDITH外科護(hù)士營(yíng)養(yǎng)知信行認(rèn)知調(diào)查表，采用部分按要求準(zhǔn)確翻譯成中文；在山西省人民醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科營(yíng)養(yǎng)專家的協(xié)助下，完成自編營(yíng)養(yǎng)問(wèn)卷的初稿。后經(jīng)小樣本預(yù)試驗(yàn)，生成正式調(diào)查表。本研究采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣的方法，從符合納入標(biāo)準(zhǔn)的4所醫(yī)院隨機(jī)抽取3所醫(yī)院的1100名護(hù)理人員進(jìn)行調(diào)查，被調(diào)查者采用匿名、獨(dú)立填寫(xiě)的方式填寫(xiě)問(wèn)卷。研究結(jié)果1正態(tài)性檢驗(yàn)樣本的營(yíng)養(yǎng)知信行認(rèn)知總分近似正態(tài)分布。2T檢驗(yàn)臨床護(hù)士營(yíng)養(yǎng)知信行認(rèn)知總分與職務(wù)、是否是責(zé)任護(hù)士、工作中是否執(zhí)行整體護(hù)理理念、是否被評(píng)為優(yōu)秀護(hù)士、是否參加營(yíng)養(yǎng)知識(shí)學(xué)習(xí)講座和管理者是否定期監(jiān)督檢查病人的營(yíng)養(yǎng)狀況之間，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前尚不能認(rèn)為不同科室、性別、工作和進(jìn)修學(xué)習(xí)情況有差異。3方差分析臨床護(hù)士營(yíng)養(yǎng)知信行認(rèn)知總分與最高學(xué)歷和人事?tīng)顩r之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前尚不能認(rèn)為不同年齡、工齡、初始學(xué)歷、職稱、月收入、責(zé)任護(hù)士任職年限、業(yè)務(wù)學(xué)習(xí)頻次對(duì)臨床護(hù)士營(yíng)養(yǎng)認(rèn)知有差異。4相關(guān)分析營(yíng)養(yǎng)認(rèn)知總分與營(yíng)養(yǎng)知識(shí)、營(yíng)養(yǎng)態(tài)度、營(yíng)養(yǎng)行為之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。其相關(guān)系數(shù)R分別為0818、0520、0610P＜001。5多元線性回歸分析得出臨床護(hù)士營(yíng)養(yǎng)知信行認(rèn)知總分與管理者是否定期監(jiān)督檢查、最高學(xué)歷、是否是責(zé)任護(hù)士和職務(wù)之間存在線性關(guān)系。研究結(jié)論1被調(diào)查護(hù)士的營(yíng)養(yǎng)知信行認(rèn)知處于一般水平，雖具有較好的營(yíng)養(yǎng)態(tài)度，但營(yíng)養(yǎng)知識(shí)和營(yíng)養(yǎng)行為還有待進(jìn)一步改善和提高。2對(duì)臨床護(hù)士營(yíng)養(yǎng)知信行認(rèn)知總分影響較大的因素為管理者是否定期監(jiān)督檢查、最高學(xué)歷、是否是責(zé)任護(hù)士和職務(wù)。3針對(duì)本研究中發(fā)現(xiàn)的影響護(hù)士營(yíng)養(yǎng)知信行認(rèn)知的主要因素，建議醫(yī)院要為臨床護(hù)士營(yíng)養(yǎng)知識(shí)的學(xué)習(xí)營(yíng)造有力條件，如增加臨床護(hù)士出外參加營(yíng)養(yǎng)學(xué)習(xí)班的經(jīng)費(fèi)，定期開(kāi)展院內(nèi)營(yíng)養(yǎng)知識(shí)講座等；同時(shí)管理者還應(yīng)加大對(duì)臨床患者營(yíng)養(yǎng)監(jiān)督檢查機(jī)制，并建立一套合理有效的績(jī)效考核方法。