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簡介：Y854873學校代碼10246學號031109286後多汰二學0博士學位遣文一、’慢病毒介導的HSVTK／GCV自殺基因系統(tǒng)對晶狀體上皮細胞的殺傷作用研究院專姓系業(yè)名指導教師眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科學楊晉盧奕教授完成日期竺竺望復旦大學博士學位論文中文摘要方法HSVTK和報告基因增強型綠色熒光蛋白EGFP共表達的慢病毒感染細胞作為試驗組，僅表達EGFP的慢病毒感染細胞和『F常細胞作為對照組。流式細胞儀檢測病毒的轉(zhuǎn)染效率，熒光顯微鏡觀察及基因組PCR年11RTPCR檢測基因在HLEC內(nèi)表達，DNALADDER和電鏡觀察HSVTK／GCV系統(tǒng)對HLEC的殺傷作用，CCK一8試劑盒檢測HSVTK／GCV系統(tǒng)的濃度與時間依賴性及其旁觀者效應(yīng)。結(jié)果慢病毒系統(tǒng)能使共表達的HSVTK和EGFP高效整合入HLEC的基因組并高效表達。當GCV濃度為10～25UG／ML時，能明顯誘導轉(zhuǎn)染HSVTL的HLEC凋亡或壞死，且隨濃度的升高和時間的延長作用增強，同時存在明顯的旁觀者效應(yīng)。在同樣的GCV濃度范圍內(nèi)對照組EGFP轉(zhuǎn)染細胞和正常細胞則無顯著毒性，但當GCV濃度25UG／ML時，由于GCV的自身毒性對照組細胞的增殖也被顯著抑制。目的方法結(jié)果第三部分LERTILEP卯3HSVT啪CV在晶狀體上皮細胞中表達的特異性及靶向殺傷作用研究LENTILEP503HSVTKEGFP／GCV對HLEC的靶向性殺傷作用分別以HLEC，HELA細胞為研究組，轉(zhuǎn)入特異性表達載體LENTILEP03一HSVTKEGFP，三天后熒光顯微鏡觀察兩組細胞熒光強度，并收集細胞作RTPCR，判斷其組織特異性表達情況。以HLEC為研究組，分別轉(zhuǎn)入非特異性表達載體LENTICMVHSVTKEGFP和特異性表達載體LENTILEP503HSVTKEGFP，通過熒光顯微鏡觀察、FACS及RTPCR比較CMV與LEP503啟動子問HSVTK表達的差異。CCK一8檢測兩系統(tǒng)的殺傷作用差異。LENTILEP503一HSVTKEGFP能在HLEC中特異性表達，但HSVTK在晶狀

簡介：目的乙肝病毒HBV的慢性感染與肝細胞癌HCC之間存在著密切的關(guān)系，然而HBV誘發(fā)HCC的確切機制仍不十分清楚。研究表明，乙肝病毒X基因HBVX及其編碼的蛋白HBX在HCC的發(fā)生中起著重要的作用，但關(guān)于HBX能否直接轉(zhuǎn)化肝細胞一直存在著爭議，其原因之一可能是缺乏合適的體外模型。本研究中，選用人源性永生化非瘤性肝細胞株QSG7701作為靶細胞，將HBVX導入QSG770L細胞，觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后肝細胞生物學特性的改變，研究HBX對QSG7701細胞的轉(zhuǎn)化作用及其機制。方法①用PCR擴增HBVX基因，將擴增產(chǎn)物克隆至真核表達載體PRC／CMV2，從而構(gòu)建重組表達質(zhì)粒PCMV／X。②將重組表達質(zhì)粒PCMV／X及空載體PRC／CMV2分別轉(zhuǎn)染QSG7701細胞，經(jīng)含G418的選擇性培基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆。RTPCR及WESTERNBLOT分別檢測轉(zhuǎn)染細胞中HBVXMRNA和HBX蛋白的表達。③WESTERNBLOT檢測重組表達質(zhì)粒PCMV／X轉(zhuǎn)染的細胞PCMVX／QSG7701、空載體PRC／CMV2轉(zhuǎn)染的細胞PRCCMV2／QSG7701以及未轉(zhuǎn)染的QSG7701細胞中CMYC及BCL2蛋白的表達差異。④用MTT比色法繪制細胞生長曲線，并計算倍增時間。⑤用流式細胞技術(shù)分析三組細胞的凋亡率及細胞周期中G1期、S期細胞分別所占的比例。⑥軟瓊脂克隆形成率實驗檢測三組細胞在軟瓊脂中非錨著依賴性生長的能力。結(jié)果①成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒PCMV／X。②RTPCR及WESTERNBLOT檢測顯示PCMV／X轉(zhuǎn)染的QSG7701細胞中有HBVXMRNA及HBX蛋白的穩(wěn)定表達。③流式細胞技術(shù)分析顯示，PCMVX／QSG7701與PRCCMV2／QSG7701以及未轉(zhuǎn)染的QSG7701細胞相比，凋亡率增高，細胞周期中G1期細胞數(shù)目所占的比例減少，而S期細胞數(shù)目所占比例增多。④MTT比色結(jié)果顯示，PCMVX／QSG7701細胞株的倍增時間與其他兩組相比明顯縮短分別為14H，29H，38H。⑤PCMV／X轉(zhuǎn)染細胞株、PRC／CMV2轉(zhuǎn)染細胞株及未轉(zhuǎn)染的QSG7701細胞株，軟瓊脂克隆形成率分別為1983±196％，176±003％，133018％，PCMV／X轉(zhuǎn)染細胞株的克隆形成率明顯高于后兩組P_005。⑥WESTERNBLOT檢測表明PCMV／X轉(zhuǎn)染細胞株中CMYC蛋白的表達水平較其他兩組高，BCL2蛋白在三組細胞中均有表達，但表達水平無明顯差異。結(jié)論①本實驗中成功構(gòu)建了含有HBVX基因的真核重組表達質(zhì)粒PCMV／X，可于體外研究HBVX基因?qū)φ婧思毎挠绊憽＂诓捎萌嗽葱哉８渭毎鸔SG7701為研究對象，建立了HBVX穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，為進一步探討HBX在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用，提供了一個有價值的細胞模型。③研究顯示HBX能夠在體外轉(zhuǎn)化正常人肝細胞QSG7701，使細胞具有惡性化生長的傾向。④HBX上調(diào)細胞中CMYC蛋白的表達。值得注意的是，HBVX轉(zhuǎn)染細胞中BCL2蛋白的表達情況與其他研究者的結(jié)果存在差別，其原因有待進一步研究。

簡介：目的了解湖南省衡陽市某職業(yè)院校學生人乳頭瘤病毒（HPV）感染的相關(guān)知識和態(tài)度及行為的現(xiàn)狀，分析影響職業(yè)院校學生HPV感染知信行水平的主要因素；研究HPV感染干預方法，分析干預效果，為在職業(yè)院校中開展HPV感染和宮頸癌防治健康教育提供參考依據(jù)。方法以“知識信念態(tài)度行為”（KAP）理論為指導，利用自行設(shè)計的量表職業(yè)院校學生HPV感染相關(guān)知識、態(tài)度和行為調(diào)查問卷，采取橫斷面調(diào)查方法對湖南省衡陽市某職業(yè)院校900名學生HPV感染相關(guān)知識、態(tài)度和行為現(xiàn)狀進行分析。將890份有效問卷數(shù)據(jù)錄入EXCEL并導入SPSS180軟件，分析主要影響職業(yè)院校學生HPV感染知識、態(tài)度和行為的因素。針對職業(yè)院校學生制定“HPV感染知信行干預措施”，運用平行對照設(shè)計，隨機選取8個班學生共465名分為對照組和干預組，每組4個班，對照組231名，干預組234名，比較干預前后兩組間HPV感染知信行的變化，評價干預效果。應(yīng)用的統(tǒng)計學方法包括T檢驗、單因素方差分析和多因素線性回歸以及重復測量方差分析等。結(jié)果（1）在890名職業(yè)院校學生中，HPV感染知信行總均分為8282±1039，有154名（1730％）聽說過HPV，他們的HPV基本知識得分在23～45之間，平均分為3743±677，各認知條目知曉率均低于50；890名學生的態(tài)度得分在21～32之間，平均得分為2671±496；行為得分在15～24之間，平均得分為1953±353。（2）年齡組越大，職業(yè)院校學生HPV感染行為得分越低；態(tài)度得分以14～19年齡組最高，年齡組間比較差異有統(tǒng)計學意義P六年制中大專連讀組三年制大專組五年制高職組，且不同年級的認知和知信行總得分差異均有統(tǒng)計學意義P（3）干預前，兩組研究對象一般資料和HPV知信行得分比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞005）。干預后，干預組與對照組的知信行總分和各維度得分比較均有顯著性差異P結(jié)論（1）職業(yè)院校學生的HPV感染相關(guān)知識、態(tài)度信念、行為總得分處于中等水平。（2）職業(yè)院校學生HPV感染知信行主要受年齡、性別、家庭居住地、學習成績、性行為史等因素影響。（3）以學校課堂講授進行健康教育能有效提高職業(yè)院校學生HPV感染知信行水平，改善他們對HPV感染的態(tài)度。

簡介：目的探討全身麻醉與椎管內(nèi)麻醉對老年病人術(shù)后認知功能的影響。方法60例擇期行全身麻醉與椎管內(nèi)麻醉的病人，ASA分級Ⅰ～Ⅱ級，年齡在60歲以上。術(shù)前用藥長托寧。全身麻醉組靜脈輸注咪達唑侖、芬太尼、維庫溴銨、異丙酚快速誘導行氣管內(nèi)插管。椎管內(nèi)麻醉組于L2～L3或L3～L4行單純硬膜外麻醉或脊一硬聯(lián)合阻滯麻醉，麻醉平面控制在T6以下，手術(shù)開始前靜脈輸注咪達唑侖。麻醉前一天及術(shù)后24和72小時分別用MINIMENTALSTATEMMS測試方法評定其認知功能。結(jié)果與術(shù)前相比，兩組病人術(shù)后24小時MMS評分均明顯降低。全身麻醉組由2397±316降至2237±375；椎管內(nèi)麻醉組由2473±298降至2387±325。其中術(shù)后72小時全身麻醉組已有78％病人恢復術(shù)前水平，而椎管內(nèi)麻醉組已無認知障礙存在。兩組病人術(shù)前及術(shù)后72小時MMS評分比較均無明顯差異。結(jié)論老年病人椎管內(nèi)麻醉比全身麻醉術(shù)后認知功能恢復較快。

簡介：陜西中醫(yī)學院碩士學位論文羥喜樹堿注射液治療單皰病毒性角膜炎的實驗研究姓名邢敏艷申請學位級別碩士專業(yè)中醫(yī)五官科學指導教師仝警安20100401水平，與模型對照組比較均有顯著性差異（P005）。結(jié)論1羥喜樹堿注射液對HSK家兔角膜上皮、基質(zhì)及前房的病變情況均有有明顯影響，可減少角膜上皮缺損程度，減輕前房反應(yīng)及縮短病程，提高家兔血清中白介素2的含量。2羥喜樹堿注射液能治療HSK，其機制可能和其可以抑制和破壞HSV的DNA的分裂，并且能夠提高機體免疫水平有關(guān)。關(guān)鍵詞羥喜樹堿注射液；單純皰疹病毒性角膜炎；角膜上皮缺損；白介素2

簡介：多能干細胞在再生醫(yī)學、組織工程和藥物發(fā)現(xiàn)與評價等領(lǐng)域極具應(yīng)用價值科學家們曾嘗試通過多種途徑獲取人的多能干細胞。但是現(xiàn)存方法的廣泛應(yīng)用在技術(shù)、細胞來源、免疫排斥、倫理、宗教或法律等方面存在諸多限制而IPS細胞能夠克服這些問題的限制被譽為生命科學領(lǐng)域新的里程碑。隨著人類對干細胞分化調(diào)控機制認識的不斷加深從人的IPS細胞將會衍生出更多種類的人類細胞IPS技術(shù)將成為細胞替代治療、新藥篩選與評價及其它用途如提供大量的種子細胞的基礎(chǔ)。在組織工程人角膜基質(zhì)的工作中基質(zhì)細胞是核心內(nèi)容之一。人角膜基質(zhì)細胞在體外培養(yǎng)時有良好的增殖能力而且能夠長期發(fā)揮生物學功能。因此獲得數(shù)量足夠、有再生活力的人角膜基質(zhì)種子細胞是組織工程開展研究的前提和基礎(chǔ)。人角膜基質(zhì)種子細胞的來源多種包括異體細胞和自體細胞。在臨床應(yīng)用中異體細胞容易產(chǎn)生免疫排斥這極大限制了它的應(yīng)用。自體細胞獲取也有一定的困難由于體細胞的體外增殖有一定限度無法從很小的角膜基質(zhì)組織中獲得大量的細胞而獲取大量角膜基質(zhì)組織又容易對正常角膜的結(jié)構(gòu)和功能造成破壞其他類型的自體細胞如骨髓間充質(zhì)干細胞、皮膚成纖維細胞或脂肪干細胞亦不能完全替代角膜基質(zhì)細胞的功能無法成為組織工程角膜基質(zhì)理想的種子細胞。人胚胎干細胞在體外有分化成各種細胞類型的能力IPS細胞的發(fā)明讓人們可以從自身體細胞獲得大量的、無免疫原性的多能干細胞因此IPS細胞來源的角膜基質(zhì)細胞成為了組織工程人角膜基質(zhì)種子細胞的非常有希望的候選。但是由于人們在人角膜基質(zhì)細胞分化的分子機制方面缺少足夠的研究導致很難在體外定向地將IPS細胞分化成足夠多的、純凈的角膜基質(zhì)細胞用于臨床。最近有大量研究證實IPS細胞帶有來源細胞的表觀遺傳學記憶IPS細胞基因組中與來源細胞有關(guān)聯(lián)的甲基化組也影響了它們的分化傾向這一發(fā)現(xiàn)啟示我們可以充分利用IPS細胞的表觀遺傳學記憶來完成那些困難的定向分化。本文中我們首先對人角膜基質(zhì)細胞進行了原代培養(yǎng)。將去除上皮和內(nèi)皮細胞層的人角膜基質(zhì)進行機械分割在培養(yǎng)板上進行貼壁培養(yǎng)后將遷出的角膜基質(zhì)細胞進行傳代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細胞具有樹突狀形狀特征核型鑒定發(fā)現(xiàn)其染色體具有人類染色體的典型特征免疫熒光檢測表明體外培養(yǎng)的基質(zhì)細胞均為波形蛋白陽性表達且不含角膜上皮細胞和角膜內(nèi)皮細胞。隨后我們用293T細胞以及第二代慢病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)制作了分別攜帶OCT4、SOX2、KLF4和CMYC四種外源性基因的慢病毒感染效率測定發(fā)現(xiàn)當病毒數(shù)量與細胞數(shù)量之比為101時感染效率超過80％。我們用四種病毒共同感染角膜基質(zhì)細胞感染后將細胞消化、接種到預先鋪有MATRIGEL基質(zhì)膠的培養(yǎng)板上將培養(yǎng)液換為小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)層條件培養(yǎng)液開始IPS細胞的誘導。誘導后第三天細胞開始出現(xiàn)了形態(tài)的改變產(chǎn)生大量上皮樣及圓形的細胞誘導后第七天到第九天培養(yǎng)板中開始出現(xiàn)人胚胎干細胞樣的細胞類型它們的核質(zhì)比較大細胞連接緊密成克隆樣生長。誘導第二十天胚胎干細胞樣的細胞團已經(jīng)非常明顯我們進行了多能性干細胞的功能標志之一堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)板中有大量堿性磷酸酶陽性細胞初步確定已成功誘導人角膜基質(zhì)細胞成為IPS細胞誘導效率為0408。綜上所述本文將人角膜基質(zhì)細胞重編程為IPS細胞賦予角膜基質(zhì)細胞無限的增殖能力為獲得大量的種子細胞奠定基礎(chǔ)。我們希望在不久的將來在此工作的基礎(chǔ)上利用IPS細胞表觀遺傳學記憶使大量擴增的角膜基質(zhì)細胞來源的IPS細胞重新定向分化為角膜基質(zhì)細胞滿足組織工程對種子細胞的需求。另外我們還可以將此IPS細胞分化為跟角膜基質(zhì)細胞在發(fā)育上關(guān)系相近的角膜中其它類型的細胞比如說角膜內(nèi)皮細胞和角膜上皮細胞從而獲得這些數(shù)量稀少且在體外難于培養(yǎng)的細胞類型用于疾病治療或理論研究。

簡介：上海交通大學碩士學位論文乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因自然序列特征分析姓名韓悅申請學位級別碩士專業(yè)臨床醫(yī)學內(nèi)科學（傳染病學）指導教師張欣欣20061001乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因自然序列特征分析ACTERISTICANALYSISOFTREATMENTNAIFHEPATITISBVIRUSREVERSETRANASESEQUENCESABSTRACTBACKGROUNDAIMHEPATITISBVIRUSHBVISAPATHOGENTHATCHRONICALLYAFFLICTSABOUT5POPULATIONWLDWIDEWITHOVERWHELMINGLYHIGHPREVALENCEINASIATHEKALEIDOSCOPICDIVERSITYOFITSCLINICALCOURSEISDETERMINEDNOTONLYBYHOSTIMMUNOLOGICALREACTIONBUTALSOMAYBEAFFECTEDBYTHEVIRUSITSELFTHEREVERSETRANASEOFHBVISTHETARGETOFANTIVIRALDRUGRTMUTANTSCANCAUSETREATMENTFAILUREOURAIMISTOCONSTRUCTATREATMENTNAFRTSEQUENCEDATABASEBYANALYZINGACTERIZINGTHESEDATAEVENTUALLYCOMBINEDWITHTHEFOLLOWUPDATACOULDHELPINTHEFUTURESTUDYOFHBVINVIVOEVOLVEMENTITSINFECTIONCOURSE、CLINICALANTIVIRALAGENTSTARGETDESIGNTOPREVENTDRUGRESISTANTMETHODSSERUMSAMPLESAREOBTAINEDFROM342TREATMENTNAFPATIENTSINFECTEDCHRONICALLYWITHHBVFROM5PROVINCESOFCHINAFROMYEAR2005TO2006BYAMPLIFYINGSEQUENCINGTHEHBVRTREGIONWEANALYZETHEMUTATIONSTATUSGENOTYPINGSUBGENOTYPINGBASEONSEQUENCEALIGNMENTRESULTLOGISTICREGRESSIONISUSEDTOTESTCRELATIONTWOSIDESTESTEDGENETREESARECONSTRUCTEDBASEDONGEICDISTANCEDEEPSEQUENCEANALYSISISUSEDTOACTERIZETHEPROPERTIESOFREVERSETRANASEREGIONRESULTSAMONGTHESESAMPLES363AREGENOTYPEBB2887WHICHISTHEMAINSTRAININSOUTHREGION637AREGENOTYPECC2922PREDOMINATINGINNTHREGIONONEGENOTYPEDTHEAVERAGEAGEOFTHOSEINFECTEDWITHGENOTYPEBIS325373FGENOTYPECTHEDIFFERENCEISSIGNIFICANTAMONGHBEAGPOSITIVEPATIENTSTHEYOUNGERTHEYARETHEHIGHERTHEVIRALLOADSWILLBEAMONGHBEABPOSITIVEPEOPLETHEOLDERTHEPATIENTISTHELOWERTHEVIRALLOADWILLBETHEGEICDISTANCEBETWEENNAFHBVSTRAINSOFMETHAN10YEARSISWITHINTHERANGEOFNMALMUTATIONRATERT’SBASESUSAGEDIFFERATTHEMONODINUCLEOTIDESLEVELSTHEMEDIANVALUESOFPOSITIONWEIGHTMATRIXSCEPWMSOFDIFFERENTREPLICATIONCAPACITYHBVSTRAINSDONOTMATCHM204VISDOMINANTMUTANTSRATIOIS18?81TVIS06THERESTACCOUNTSF93THETOTALHETEROZYGOSISSITESRATEIS377CONCLUSIONPRIMARILYEXISTEDMUTANTSTRAINSMAYBETHECAUSEOFPRIMARYSECONDARYTREATMENTFAILURETHEBIASESFOUNDEDABOVESUGGESTINGTHATHBVISTAKINGADVANTAGEOFTHEHOSTHEPATOCYTEREPLICATIONMECHANISMTOHELPITSELFNEEDFURTHERSTUDYTHEDATABASEWECONSTRUCTEDTHEKNOWLEDGEWEGAINEDWILLHELPUSINTHEFUTURESTUDYOFHBVINVIVOEVOLVEMENTITSINFECTIONCOURSE、CLINICALANTIVIRALAGENTSTARGETDESIGNTOPREVENTDRUGRESISTANTKEYWDSHEPATITISBVIRUSREVERSETRANASETREATMENTNAFPHYLOGENESISGENOTYPE

簡介：點擊查看更多丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白5B與細胞蛋白CINP相互作用影響細胞周期及其機制的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：點擊查看更多拉米夫定加阿德福韋酯初始聯(lián)合與恩替卡韋單藥治療HBeAg陽性高病毒載量慢性乙型肝炎的對比研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：已知正鏈RNA病毒基因復制多定位在宿主內(nèi)的特定膜結(jié)構(gòu)上，由病毒RNA、病毒蛋白與宿主蛋白相互作用并對宿主膜結(jié)構(gòu)進行改造，形成膜相關(guān)的病毒基因復制復合體。目前認為HCV的基因復制也采用類似的機制，在GOLGI體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上起始，由HCVRNA、病毒蛋白與宿主蛋白形成多成分復合體。已有文獻報道HCV可通過其非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主蛋白HVAP33的相互作用，在類似脂筏的結(jié)構(gòu)上組裝病毒基因復制復合體。為進一步研究HCV基因復制復合體REPLICATIONCOMPLEXES，RC的組成及其參與HCV復制調(diào)控的機理，本文首先應(yīng)用HCV的亞基因組復制子模型下簡稱復制子，用不連續(xù)蔗糖梯度分離復制子細胞中的脂筏成分，WESTERNBLOT及RTPCR分析結(jié)果顯示HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3，NS5A和NS5B及基因組與脂筏的標志蛋白CAVEOLIN2分布一致，提示其分布于脂筏成分。進一步用脂筏刪除試劑MPCD處理復制子細胞后，發(fā)現(xiàn)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白及其正、負鏈RNA在脂筏上的定位明顯減少，且HCVNS5A蛋白與已知HCVRC組分之一HVAP33蛋白的共定位消失，確認HCVRC存在于脂筏成分。將分離獲得的脂筏成分蛋白用雙向電泳分離，各蛋白點胰酶消化后用MALDITOFMATRIXASSISTEDLASERDESPTION／IONIZATIONTIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRY質(zhì)譜進行鑒定。共鑒定出325個蛋白點，主要包括線粒體蛋白、信號分子、胞內(nèi)運輸?shù)鞍住⒓毎羌艿鞍?、參與翻譯及RNA加工的蛋白等。其中包括已經(jīng)報道的與HCV基因組發(fā)生相互作用的蛋白如ACTIN，EIF3SUBUNIT2，ELF3P44，UNRPROTEIN，HNRNPK，HNRNPGHNRNPL，UNRINTEMCTINGPROTEINS等；及與HCV蛋白發(fā)生相互作用的蛋白如HISTONE，1433PROTEIN，F(xiàn)YN，APOE和CYCLOPHILINB等。為確定脂筏蛋白中可能與HCV發(fā)生聯(lián)系的蛋白，先利用生物信息學以已有的蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，結(jié)合最近發(fā)表的文獻，對鑒定到的蛋白間的相互作用進行整理，得到相互作用圖譜。結(jié)果顯示蛋白相互作用圖譜中與HCV發(fā)生聯(lián)系的蛋白主要是細胞骨架蛋白，信號分子及HNRNP。此外，利用比較蛋白質(zhì)組學，以復制子細胞的母細胞系HUH7作為對照，在復制子的脂筏蛋白中有60個蛋白發(fā)生上調(diào)，其中包括在蛋白相互作用圖譜中與HCV發(fā)生聯(lián)系的蛋白，如HSC71，TCOMPLEXPROTEIN和ELF3。再在復制子細胞中瞬時轉(zhuǎn)染DSRED融合的脂筏蛋白，共聚焦分析是否與HCVNS5A共定位。結(jié)果顯示UBIQUITINFUSIONDEGRADATIONPROTEINLHOMOLOGUFDLL，SNAPΓ，SYTAXINL7，PA28Β，RASGTPASEACTIVATINGPROTEINBINDINGPROTEIN1G3BPL和NUCLEO曲OSMINNPM可與NS5A發(fā)生共定位。鑒于SNAPY與SYTAXINL7和HVAP33同為SNARE家族成員，進一步用NETHYLMALEIESENSITIVEFACTNSF的永久失活體NSFDN在復制子中抑制SNARE介導的膜運輸，發(fā)現(xiàn)NSFDN能解離HCVRC，抑制HCV的復制。另外，在復制子中用針對G3BPI的SIRNA干擾G3BPL的表達，顯示可下調(diào)HCV的復制P0027，提示G3BPL可能為HCVRC的潛在成分進一步蛋白相互作用顯示G3BPL與HCVNS5B相互作用；且定位于脂筏。本研究從分離鑒定含有HCVRC的脂筏成分入手，利用蛋白組學技術(shù)結(jié)合功能生物學分析，找到包括G3BPL等一些可能為參與HCV基因復制的細胞蛋白，為進一步研究HCV復制機制和研制抗HCV藥物打下了良好的基礎(chǔ)。

簡介：第一章人脂聯(lián)素基因的克隆和真核表達目的克隆人脂聯(lián)素基因APML，構(gòu)建真核表達載體PCDEFAPML，檢測其在HEK293細胞中的表達水平，為脂聯(lián)素基因重組腺病毒的構(gòu)建和表達提供實驗基礎(chǔ)；并構(gòu)建球狀脂聯(lián)素GADIPONECTIN基因的真核表達載體，檢測其在人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC中的表達，為進一步研究脂聯(lián)素、球狀脂聯(lián)素的功能提供實驗基礎(chǔ)。方法應(yīng)用RTPCR法自人大網(wǎng)膜脂肪組織的總RNA中擴增出APMLCDNA全長基因，采用TA克隆法重組到PGEMTVECTSYSTEM中，通過藍白斑篩選出陽性克隆后，測序鑒定。用PCR法從測序正確的PGEMTAPML質(zhì)粒上，擴增出兩端帶有SFII酶切位點的人脂聯(lián)素基因，再將擴增出的片斷亞克隆到T載體上，用SFII酶切T載體和PCDEF空載體，將酶切后的片斷進行連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定、測序。將成功構(gòu)建的PCDEFAPML質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞，雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清中脂聯(lián)素的表達水平。以構(gòu)建好的質(zhì)粒PGEMTAPML為模板，PCR擴增出兩端帶有XHOI和HINDIII酶切位點的人球狀脂聯(lián)素基因，將PCR產(chǎn)物和PCDEF／PPTMYCHIS一A載體雙酶切后進行連接、轉(zhuǎn)化、篩選、測序。將成功構(gòu)建的真核表達載體轉(zhuǎn)染HUVEC細胞，WESTERNBLOT檢測上清液中人球狀脂聯(lián)素蛋白的表達。結(jié)果從脂肪組織總RNA中擴增得到735BPAPML基因，其CDNA序列與GENBANK報導的人脂聯(lián)素基因APML同源性為997％159位和558位堿基發(fā)生了無義突變，獲得了質(zhì)粒PGEMTAPML，測序鑒定正確。構(gòu)建的PCDEFAPML質(zhì)粒測序正確，能有效轉(zhuǎn)染HEK293細胞，并在培養(yǎng)上清中檢測到較高水平的脂聯(lián)素蛋白。構(gòu)建的GADIPONECTIN基因的真核表達載體，經(jīng)酶切、測序鑒定正確，并有效的轉(zhuǎn)染了HUVEC，經(jīng)WESTERNBLOT在上清中檢測到了該基因的表達。結(jié)論成功的克隆了APML基因全長CDNA。構(gòu)建了人脂聯(lián)素基因的真核表達載體PCDEFAPML，并在HEK293細胞中獲得高效表達；成功的構(gòu)建并鑒定了人球狀脂聯(lián)素基因真核表達載體，在HUVEC細胞中獲得了分泌表達，為人脂聯(lián)素基因重組腺病毒的構(gòu)建和表達奠定了基礎(chǔ)。第二章人脂聯(lián)素基因重組腺病毒的構(gòu)建、鑒定和表達目的構(gòu)建含有人脂聯(lián)素基因APML的重組腺病毒載體，制備能表達人脂聯(lián)素蛋白的重組腺病毒，為脂聯(lián)素用于體內(nèi)外干預動脈粥樣硬化奠定基礎(chǔ)。方法自質(zhì)粒PGEMTAPML上擴增兩端帶有SALI和HINDIII酶切位點的全長APML基因，將PCR產(chǎn)物和穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMV經(jīng)SALI和HINDLII雙酶切后，連接、轉(zhuǎn)化、篩選，進行PCR鑒定后送雙向測序。將鑒定正確的重組質(zhì)粒PSHUTTLECMVAPML用PMEI酶切使其線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒PADEASY1共轉(zhuǎn)BJ5183菌，進行細菌內(nèi)同源重組，篩選、鑒定、擴增，PACI酶切后用LIPOFECTAMIM2000轉(zhuǎn)染低代數(shù)的HEK293包裝細胞，進行包裝出毒，并用HELA細胞檢測重組腺病毒的生物安全性。重組腺病毒進行鑒定、擴增后，測定病毒滴度，感染HUVEC、HEPG2細胞，確定最佳MOI，觀察對HUVEC、HEPG2細胞生長的影響，并用ELISA檢測上清中人脂聯(lián)素蛋白的水平，WESTERNBLOT檢測細胞中人脂聯(lián)素蛋白的表達。結(jié)果重組穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMVAPML經(jīng)PCR和測序鑒定正確，與腺病毒骨架質(zhì)粒PADEASY1同源重組成功，轉(zhuǎn)染293細胞進行包裝，產(chǎn)生的病毒經(jīng)鑒定正確，并且無具有復制能力的腺病毒存在，生物安全性高，在HUVEC、HEPG2細胞培養(yǎng)上清和細胞中檢測到APML基因的蛋白表達。結(jié)論成功的制備了APML基因重組腺病毒，并在HUVEC和HEPG2細胞中獲得分泌表達，可進一步用于脂聯(lián)素干預動脈粥樣硬的研究。第三章人脂聯(lián)素基因重組腺病毒對HUVEC細胞的影響目的研究人脂聯(lián)素基因重組腺病毒對HUVEC細胞的影響，觀察人脂聯(lián)素基因重組腺病毒保護血管內(nèi)皮細胞和體外抗動脈粥樣硬化的作用。方法用人脂聯(lián)素基因重組腺病毒感染HUVEC細胞，雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清中人脂聯(lián)素、IL10的表達水平，WESTERNBLOT檢測人脂聯(lián)素蛋白、MCP1、ICAM1、INOS、ENOS蛋白表達，比色法檢測總NOS、INOS、ENOS活力，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛水平，黃嘌呤氧化酶法測定SOD水平。結(jié)果用含報告基因LACZ的對照腺病毒ADLACZ感染HUVEC細胞，檢測腺病毒的感染效率，確定最佳MOI為50，用MOI為50的人脂聯(lián)素基因重組腺病毒感染HUVEC細胞，24H、48H、72H后取上清檢測脂聯(lián)素濃度分別為140±9NGML、185±8NGML、170±10NGML。感染了ADAPML的HUVEC細胞上清總NO、IL10水平顯著升高；總NOS和ENOS的活力和蛋白表達顯著升高，而INOS的活力和蛋白表達顯著降低。感染了ADAPML的HUVEC細胞SOD的活力顯著升高，而產(chǎn)生的丙二醛含量顯著降低。感染了ADAPML的HUVEC細胞MCP1和ICAM1蛋白表達顯著降低。結(jié)論我們制備的重組腺病毒能有效感染HUVEC細胞并分泌表達人脂聯(lián)素蛋白，可上調(diào)HUVEC細胞總NO、總NOS和ENOS的活力和蛋白表達，下調(diào)INOS的活力和蛋白表達，具有抗氧化、保護血管內(nèi)皮細胞的作用。而且還能使具有抗動脈粥樣硬化作用的細胞因子IL10的表達水平顯著升高，下調(diào)黏附分子MCP1和ICAM1蛋白表達。這些結(jié)果顯示我們制備的人脂聯(lián)素基因重組腺病毒在體外具有生物活性，具有抗動脈粥樣硬化的作用，可以進一步用于體內(nèi)干預動脈粥樣硬化，延緩糖尿病動脈粥樣硬化的形成。

簡介：點擊查看更多唾液酸乳糖的攝入對仔豬腦發(fā)育、認知功能、視覺發(fā)育及唾液酸表達的影響.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：第二軍醫(yī)大學碩士學位論文腺病毒介導IL24治療肝癌及其作用機制的實驗研究姓名康曉燕申請學位級別碩士專業(yè)腫瘤學指導教師殷正豐20060501第二軍醫(yī)大學摘要碩士學位論文腺病毒介導IL一24治療肝癌及其作用機制的實驗研究摘要目的研究重組腺病毒介導IL．24AD．IL．24治療肝癌的作用及其機制。方法構(gòu)建、制備、擴增和純化AD．IL．24。應(yīng)用CPE、MTT、DNA片段化分析和流式細胞儀等方法測定AD．IL．24感染人肝癌細胞株BEL一7402、HEPG2、PLC／PRF／5和正常人肝細胞株L02后生長和凋亡的變化。皮下接種HEPG2細胞建立肝癌裸鼠模型，瘤內(nèi)單點注射AD．IL．24，觀察瘤質(zhì)量和瘤體積的變化，檢測腫瘤組織內(nèi)IL．24、活化CASPASE．3、細胞凋亡率、KI．67和微血管密度MVD。結(jié)果AD．IL．24病毒滴度為1．O1011TCID50／ML。感染細胞在MRNA和蛋白質(zhì)水平上高表達IL．24。與AD．VECTOR對照組相比，AD．IL．24感染對正常人肝細胞生長和凋亡的影響無統(tǒng)計學顯著差異PO．05，但可顯著抑制肝癌細胞生長P0．01，顯著增加肝癌細胞凋亡百分率P0．01。肝癌裸鼠AD．IL一24治療組腫瘤體積和質(zhì)量顯著降低，與對照組之間具有統(tǒng)計學顯著差別PO．05。組織病理切片檢測結(jié)果表明，AD．IL一24組腫瘤組織表達IL一24蛋白，活化CASPASE一3和凋亡率顯著增高，而KI．67抗原和MVD顯著降低。這些指標與對照組之間均具有統(tǒng)計學顯著差別PO．05。結(jié)論AD．IL．24是一個高效的LL．24基因轉(zhuǎn)移和表達系統(tǒng)，在體內(nèi)外能選擇性誘導肝癌細胞生長抑制和凋亡，其作用機制可能涉及促凋亡、抑制增殖和抗血管生成。關(guān)鍵詞MDA．7；IL．24；腺病毒；肝癌；凋亡2

簡介：第一部分肝炎病毒性心肌炎患者抗Β1腎上腺素能受體抗體的觀察目的觀察抗Β腎上腺素能受體抗體在肝炎病毒性心肌炎中的檢出率及其可能的臨床意義方法103例病毒性心肌炎患者根據(jù)病原學檢測ELISA法檢測甲、乙、丙肝炎病毒抗體RTPCR法檢測腸病毒分為肝炎病毒性心肌炎組N29和腸病毒性心肌炎組N74觀察指標包括抗Β腎上腺素能受體抗體ELISA法檢測肝功能磷酸肌酸激酶CK和肌鈣蛋白CTNT心電圖超聲心動圖等第二部分肝炎病毒心肌炎患者抗Β腎上腺素能受體抗體增加心肌細胞鈣電流和胞內(nèi)鈣濃度的研究目的研究肝炎病毒心肌炎患者抗Β腎上腺素能受體抗體對心肌細胞動作電位、L型鈣電流和胞內(nèi)鈣的的影響方法15例抗Β腎上腺素能受體抗體陽性的肝炎病毒性心肌炎患者血清經(jīng)辛酸提取法提取IGGLANGENDFF37℃恒溫灌流酶解分離心肌細胞通過免疫熒光顯示抗Β1腎上腺素能受體抗體與豚鼠心肌細胞的結(jié)合利用膜片鉗技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)觀察抗Β腎上腺素能受體抗體對豚鼠心肌細胞動作電位、L型鈣電流和胞內(nèi)鈣的影響以及美托洛爾的藥物干預情況通過對比加入抗體前后心肌細胞的形態(tài)變化和臺盼藍染色情況觀察抗體對心肌細胞的毒性第三部分乙型肝炎病毒誘導小鼠抗Β腎上腺素能受體抗體產(chǎn)生及其致心律失常的機制目的通過在體和離體動物實驗探索乙型肝炎病毒誘導的抗Β腎上腺素能受體抗體在肝炎病毒性心肌炎發(fā)生和發(fā)展中的作用方法實驗組N30于實驗第11428和42天4次以乙型肝炎病毒與完全弗氏佐劑混合成乳化劑接種對照組N30用生理鹽水按同樣的方法假性免疫兩組小鼠分別于實驗O、13、27和34天記錄心電圖第O142835天眼內(nèi)眥靜脈取血第56天摘眼球取血并留取心臟和肝臟標本ELISA法檢測抗Β腎上腺素能受體抗體光學顯微鏡下觀察心肌和肝臟的病變通過免疫熒光顯示小鼠抗Β腎上腺素能受體抗體與豚鼠心肌細胞的結(jié)合用辛酸提取法提純小鼠IGG通過膜片鉗技術(shù)觀察小鼠抗Β腎上腺素能受體抗體對豚鼠心肌細胞動作電位、L型鈣電流的影響

簡介：目的近年來由ECHO病毒引起暴發(fā)疾病逐漸增多但由于完整系統(tǒng)監(jiān)測資料的缺乏、對腸道病毒病原特性及危害性的認識不足以及病原檢測技術(shù)的落后中國在有關(guān)腸道病毒生物信息學資料的積累方面仍然十分貧乏對該病的防治工作極為不利。腸道病毒頻繁的基因重組以及遺傳變異、新型腸道病毒EV79、91等的不斷出現(xiàn)提示我們應(yīng)該加強對腸道病毒的流行病學監(jiān)測與實驗室檢測開發(fā)研究腸道病毒非結(jié)構(gòu)編碼序列了解病毒基因重組及抗原性改變情況建立快速、準確、標準化的分子生物學檢測方法。河南省于2008年從病毒性腦炎患者腦脊液中分離出4株ECHO25鑒于目前世界腸道病毒基因組數(shù)據(jù)庫中除ECH025分離株JV4外尚沒有1株ECHO25流行毒株及臨床分離株的完整基因組信息。為了解河南ECHO25病毒ENTRICCYTOPATHICHUMANPHANVIRUSESTYPE25分離株基因變異情況、病毒基因組不同區(qū)域在病毒基因進化中是否表現(xiàn)相對獨立、與其他腸道病毒B組間同源性及其重組情況特對河南省分離的ECHO25進行基因序列的測定。方法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR擴增出病毒VP1蛋白編碼基因及全基因序列并進行序列測定VP1區(qū)經(jīng)CLUSTALX181將河南4株ECHO25分離株及所有參考毒株對齊后用MEGA40鄰位相連法NJ建樹。全基因序列分析采用DNASTAR中的SEQMAN拼接所測全基因序列、MEGALIGN將所有參與比對序列對齊用BIOEDIT進行同源性比較；SIMPLOT351采用200個核苷酸的滑動窗口以20個核苷酸的步伐從基因組5’端向3’端方向滑動進行相似性及重組分析。DNASTAR中的PROTEAN分析其氨基酸組成、二級結(jié)構(gòu)、親水性及表面抗原等。結(jié)果14株ECHO25河南分離株核苷酸同源性為930％～990％氨基酸同源性為924％～975％；其中HN35洛陽分離株核苷酸變異最大與其余3株河南分離株HN01HN02HN26核苷酸差異達68％～7％HN01開封分離株與HN26洛陽分離株之間高度同源其核苷酸同源性達990％；4株ECHO25河南省分離株與原型株JV4核苷酸同源性最低為792％～801％；所有參考序列間氨基酸同源性較高為89％～989％核苷酸同源性相對較低為771％～981％；2河南省4株ECHO25同屬B1基因亞型；3所測HN02河南分離株基因組全長7423BP與原型株JV4編碼區(qū)核苷酸差異為188％氨基酸差異為35％。其中VP4VP2核苷酸差異為186％～192％、VP1核苷酸差異為196％；P2、P3核苷酸差異分別為175％、199％。9種型別人腸道病毒B組比對發(fā)現(xiàn)不同型別間VP4VP2核苷酸差異為205％～343％、VP1核苷酸差異為309％～401％P2、P3核苷酸差異為110％～194％；4HEVB組間UTRS與非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)P2P3相似度要遠大于P1區(qū)衣殼蛋白VP4VP2VP1編碼基因；5河南分離株氨基酸組成以非極性的亮氨酸最多占79％；其次是非極性的纈氨酸占78％；極性的色氨酸最少占15％。二級結(jié)構(gòu)以Β折疊為主其次為Α螺旋和Β轉(zhuǎn)角少有無規(guī)則卷曲親水性高存在多個潛在的抗原表位位點。結(jié)論1與國外原型株JV4不同已形成新的基因亞型B1；2與原型株JV4相比HN02株編碼區(qū)發(fā)生沉默突變其核苷酸變異并不影響氨基酸序列的變化；3SIMPLOT重組分析結(jié)果提示河南ECHO25分離株存在基因重組其基因組各分區(qū)在基因進化中并不同步。